Giardia duodenum เป็นสิ่งมีชีวิตปรสิตที่ทำให้เกิดโรค Giardiasis ซึ่งเป็นการติดเชื้อในลำไส้โดยเฉพาะในเด็กเล็กที่มีอาการทางคลินิกของโรคท้องร่วงก่อนหน้านี้เราได้รายงานว่า extracell G. duodenalis กระตุ้นการกระตุ้นการทำงานของนิวคลีโอไทด์ที่มีลักษณะคล้ายโอลิโกเมอไรเซชันภายในเซลล์ 3 (NLRP3) และควบคุมการตอบสนองการอักเสบของโฮสต์ผ่านการหลั่งนอกเซลล์ตุ่ม (EV)อย่างไรก็ตาม รูปแบบโมเลกุลที่แน่นอนของ duodenococcal EV (GEV) ที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการนี้ และบทบาทของ NLRP3 inflammasome ใน giardiasis ยังคงต้องมีการอธิบายอย่างชัดเจน
พลาสมิดของการแสดงออกของยูคาริโอตชนิดลูกผสม pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ alpha-7.3 giardins ใน GEV ถูกสร้างขึ้น ทรานส์เฟกไปเป็นมาโครฟาจในช่องท้องปฐมภูมิของหนูเมาส์ และตรวจพบโดยการวัดโมเลกุลเป้าหมายการอักเสบ caspase-1ระดับการแสดงออก p20 ถูกคัดกรอง-G. duodenalis alpha-2 และ alpha-7.3 giardines เดิมถูกระบุโดยการวัด NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β), pro-caspase-1 และ caspase-1 p20), การหลั่ง ILระดับ 1β, ระดับโอลิโกเมอไรเซชันของโปรตีน apoptotic (ASC) และการแปลตำแหน่งอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ NLRP3 และ ASCจากนั้นประเมินบทบาทของ NLRP3 inflammasome ในการทำให้เกิดโรคของ G. duodenalis โดยใช้หนูที่ถูกบล็อกการเปิดใช้งาน NLRP3 (หนูที่ถูกบล็อก NLRP3) และการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพของน้ำหนักตัว โหลดปรสิตในลำไส้เล็กส่วนต้น และเนื้อเยื่อในลำไส้เล็กส่วนต้นนอกจากนี้เรายังตรวจสอบว่า hiardines alpha-2 และ alpha-7.3 กระตุ้นให้เกิดการหลั่ง IL-1β ในร่างกาย ผ่านทาง NLRP3 inflammasome และกำหนดบทบาทของโมเลกุลเหล่านี้ในการทำให้เกิดโรคของ G. duodenalis ในหนูหรือไม่
Alpha-2 และ alpha-7.3 giardines กระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในหลอดทดลองสิ่งนี้นำไปสู่การกระตุ้น p20 caspase-1 การเพิ่มขึ้นของระดับการแสดงออกของโปรตีน NLRP3, pro-IL-1β และ pro-caspase-1 การเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการหลั่ง IL-1β การก่อตัวของจุด ASA ใน พลาสซึมและการเหนี่ยวนำของ ASA oligomerizationการอักเสบ NLRP3 การสูญเสียอวัยวะเพศชายทำให้การก่อโรคของ G. duodenalis ในหนูรุนแรงขึ้นหนูที่รักษาด้วยซีสต์โดย gavage จากหนูที่ถูกบล็อก NLRP3 มีจำนวนโทรโฟซอยต์เพิ่มขึ้นและความเสียหายอย่างรุนแรงต่อวิลไลในลำไส้เล็กส่วนต้น โดยมีลักษณะเฉพาะคือห้องใต้ดินแบบเนื้อตายที่หดตัวและแตกแขนงการทดลอง ในสัตว์ทดลอง แสดงให้เห็นว่า giardines alpha-2 และ alpha-7.3 สามารถกระตุ้นการหลั่งของ IL-1β ผ่านทาง NLRP3 inflammasome และการสร้างภูมิคุ้มกันด้วย giardines alpha-2 และ alpha-7.3 ช่วยลดการเกิดโรคของ G. duodenalis ในหนูทดลองได้
เมื่อนำมารวมกัน ผลการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่า giardia alpha-2 และ alpha-7.3 ทำให้เกิดการควบคุมการอักเสบของโฮสต์ NLRP3 และลดการติดเชื้อของ G. duodenalis ในหนู ซึ่งเป็นเป้าหมายที่น่าหวังในการป้องกัน giardiasis
Giardia duodenum เป็นปรสิตโปรโตซัวนอกเซลล์ที่อาศัยอยู่ในลำไส้เล็กและทำให้เกิดโรคไจอาร์เดียสด้วยอาการท้องร่วงปีละ 280 ล้านราย โดยเฉพาะในเด็กเล็กในประเทศกำลังพัฒนา [1]ผู้คนติดเชื้อจากน้ำดื่มหรืออาหารที่ปนเปื้อนซีสต์ M. duodenum ซึ่งจะเข้าสู่กระเพาะอาหารและถูกขับออกมาทางน้ำย่อยGiardia duodenum trophozoites เกาะติดกับเยื่อบุลำไส้เล็กส่วนต้น ทำให้เกิดอาการคลื่นไส้ อาเจียน ท้องร่วง ปวดท้อง และน้ำหนักลดบุคคลที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องและโรคซิสติกไฟโบรซิสมีความเสี่ยงต่อการติดเชื้อการติดเชื้ออาจเกิดขึ้นได้จากการร่วมเพศทางปากและทวารหนัก [2]ยาเช่น metronidazole, tinidazole และ nitazoxanide เป็นทางเลือกในการรักษาที่แนะนำสำหรับการติดเชื้อในลำไส้เล็กส่วนต้น [3]อย่างไรก็ตาม ยาเคมีบำบัดเหล่านี้ทำให้เกิดผลข้างเคียง เช่น อาการคลื่นไส้ การก่อมะเร็ง และความเป็นพิษต่อพันธุกรรม [4]ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการพัฒนากลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นเพื่อป้องกันการติดเชื้อ G. duodenalis
Inflammasomes เป็นกลุ่มของโปรตีนเชิงซ้อนในเซลล์ที่เป็นส่วนหนึ่งของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ ซึ่งช่วยป้องกันการบุกรุกของเชื้อโรคและเป็นสื่อกลางในการตอบสนองการอักเสบ [5]ในบรรดาการอักเสบเหล่านี้ oligomerization ที่มีผลผูกพันกับนิวคลีโอไทด์ (NOD) ตัวรับ 3 (NLRP3) oligomerization ที่มีผลผูกพันกับนิวคลีโอไทด์ (NLRP3) การอักเสบที่คล้ายนิวคลีโอไทด์ที่มีผลผูกพันได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางเนื่องจากสามารถตรวจพบโดยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค / ความเสียหาย (PAMP/ DAMP) รับรู้ กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและควบคุมสภาวะสมดุลของลำไส้ในโรคอักเสบหลายชนิด [6,7,8]มันประกอบด้วยตัวรับการจดจำรูปแบบ (PRR) NLRP3, โปรตีนจุดอะพอพโทติก (ASC) ของตัวปรับต่อ และเอฟเฟกเตอร์ โพรแคสเพส-1 หรือโพรแคสเพส-11การอักเสบของ NLRP3 ทำหน้าที่เป็นโฮสต์ในการต่อต้านการบุกรุกของเชื้อโรค ดังที่พบใน Neospora caninum [9] Paracoccidioides brasiliensis [10] และการศึกษาของ Leishmania[11] แต่มีรายงานด้วยว่าการกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome จำกัดการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในการป้องกัน และทำให้การลุกลามของโรครุนแรงขึ้น เช่น ในหนอน [12]จากการค้นพบครั้งก่อนของเรา เรารายงานว่า G. duodenalis นอกเซลล์กระตุ้นการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 ภายในเซลล์ และปรับการตอบสนองการอักเสบของโฮสต์โดยการหลั่งถุงนอกเซลล์ (EVs) [13]อย่างไรก็ตามบทบาทของ NLRP3 inflammasome ในการติดเชื้อ G. duodenalis ในร่างกาย ยังคงได้รับการพิจารณา
เดิมที Giardins ถูกอธิบายว่าเป็นส่วนประกอบโครงสร้างของ G. duodenalis cytoskeleton และมีบทบาทสำคัญในการเคลื่อนที่ของ trophozoite และการเกาะติดของเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้เล็กเพื่อปรับตัวเข้ากับสภาพแวดล้อมได้ดีขึ้นและเพิ่มความสามารถในการทำให้เกิดโรค G. duodenalis trophozoites ได้พัฒนาโครงสร้างโครงร่างโครงร่างที่มีเอกลักษณ์เฉพาะ ซึ่งประกอบด้วยแฟลเจลลา 8 ชิ้น ตัวส่วนกลาง 1 ชิ้น และแผ่นดิสก์หน้าท้อง 1 ชิ้น [14]โทรโฟซอยต์ของ Giardia duodenum ใช้โครงร่างโครงกระดูกของพวกมันเพื่อเจาะลำไส้เล็กตอนบน โดยเฉพาะลำไส้เล็กส่วนต้น และเกาะติดกับเอนเทอโรไซต์พวกมันจะโยกย้ายและเกาะติดกับเซลล์เยื่อบุผิวอย่างต่อเนื่องโดยใช้เมแทบอลิซึมของเซลล์ดังนั้นจึงมีความสัมพันธ์ใกล้ชิดระหว่างโครงกระดูกและความรุนแรงของพวกมันGiardines เฉพาะสำหรับ Giardia duodenum เป็นส่วนประกอบของโครงสร้างโครงร่างโครงร่างของเซลล์ [15] และแบ่งออกเป็นสี่ประเภท: α-, β-, γ- และ δ-giardinesมีสมาชิกในกลุ่ม α-giardin จำนวน 21 ราย ซึ่งทั้งหมดนี้มีความสามารถในการจับกับฟอสโฟลิพิดขึ้นอยู่กับแคลเซียม [16]พวกมันยังเชื่อมต่อโครงร่างโครงร่างกับเยื่อหุ้มเซลล์ด้วยในบุคคลที่มีอาการท้องเสียที่เกิดจากเชื้อ G. duodenalis พบว่า α-giardins มีการแสดงออกสูงและมีปฏิกิริยาตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในระหว่างการติดเชื้อ [17]วัคซีนชนิด Heterologous ที่มีพื้นฐานมาจาก Giardia alfa-1 สามารถป้องกันเชื้อ Giardiasis ในหนูทดลองได้ และเป็นแอนติเจนที่มีศักยภาพในการพัฒนาวัคซีน [18]Alpha-8 giardin ซึ่งอยู่ในพลาสมาเมมเบรนและแฟลเจลลา แต่ไม่อยู่ในแผ่นดิสก์หน้าท้อง ช่วยเพิ่มอัตราการเคลื่อนไหวและการเติบโตของโทรโฟซอยต์ใน G. duodenalis [19]Alpha-14 giardin ยึดติดกับโครงสร้าง microtubule บน flagella และส่งผลต่อความมีชีวิตของ G. duodenalis [20]Alpha-11 giardine มีจำนวนมากตลอดวงจรชีวิต และการแสดงออกของ alpha-11 giardine ที่มากเกินไปจะสร้างความเสียหายให้กับ G. duodenalis เอง [21]อย่างไรก็ตาม ยังไม่ชัดเจนว่า alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine สามารถป้องกันการติดเชื้อ G. duodenalis และกลไกพื้นฐานของพวกมันได้หรือไม่
ในการศึกษานี้ พลาสมิดของการแสดงออกของยูคาริโอตรีคอมบิแนนท์ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine และ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ถูกแปลงร่างไปเป็นมาโครฟาจปฐมภูมิทางช่องท้องของหนูเมาส์เพื่อกระตุ้นการทำงานของโฮสต์ NLRP3จากนั้นจึงคัดกรองเป้าหมายที่ทำให้เกิดการอักเสบนอกจากนี้เรายังประเมินบทบาทของ NLRP3 inflammasome ในการทำให้เกิดโรคของ G. duodenalis ตรวจสอบว่า alpha-2 และ alpha-7,3 giardines กระตุ้นการกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในร่างกาย หรือไม่ และพิจารณาว่าทั้งสองบทบาทของ giardines ในการเกิดโรคของ G. ลำไส้เล็กส่วนต้นเป้าหมายร่วมกันของเราคือการพัฒนาเป้าหมายที่มีแนวโน้มในการป้องกันการติดเชื้อ G. duodenalis
หนูพันธุ์ Wild (WT) C57BL/6 ตัวเมียอายุ 5-8 สัปดาห์ถูกซื้อจากศูนย์ทดลองสัตว์ Liaoning Changsheng (เหลียวหนิง ประเทศจีน)หนูสามารถเข้าถึงน้ำได้ฟรี ได้รับอาหารฆ่าเชื้อ และถูกเก็บไว้ในวงจรแสง/มืด 12/12 ชั่วโมงก่อนการติดเชื้อ หนูจะได้รับยาปฏิชีวนะไม่จำกัดในน้ำดื่มที่เสริมด้วย ampicillin (1 มก./มล.) vancomycin (1 มก./มล.) และนีโอมัยซิน (1.4 มก./มล.) (ทั้งหมดซื้อจากเซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน สิ่งมีชีวิตเทียม) [22 ]-หนูที่สูญเสียความสามารถในการกินและดื่มเป็นเวลา > 24 ชั่วโมงและสูญเสียน้ำหนักตัว ≥ 20% จะถูกการุณยฆาตอย่างมนุษย์โดยอาการเคลื่อนของปากมดลูก
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) เสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 12.5% ​​(FBS; Every Green, Zhejiang, จีน) และน้ำดีวัว 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) ภายใต้สภาวะไมโครแอโรบิกโทรโฟซอยต์ที่ไหลมารวมกันถูกรวบรวมบนน้ำแข็งและผ่านในอัตราส่วน 1:4 เพื่อการสืบพันธุ์ต่อไป
ซีสต์ Giardia duodenum ถูกชักนำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] โทรโฟซอยต์ถูกเก็บเกี่ยวในระยะลอการิทึม จากนั้นเจือจางด้วยตัวกลางที่เหนี่ยวนำการห่อหุ้ม ค่า pH 7.1 (แก้ไข TYI-S-33) จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1 × 106 โทรโฟซอยต์/มล.ความเข้มข้นของน้ำดี 0.05% ปานกลาง)เพาะเลี้ยงโทรโฟซอยต์ภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนที่อุณหภูมิ 37°C จนกระทั่งถึงระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึมเปลี่ยนตัวกลางเป็นตัวกลางที่กระตุ้นให้เกิดซีสต์ (pH 7.8; ตัวกลาง TYI-S-33 ที่ได้รับการดัดแปลงโดยมีความเข้มข้นของน้ำดี 1%) และเพาะเลี้ยง G. duodenalis ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 48–96 ชั่วโมง ในระหว่างนั้นสังเกตการก่อตัวของซีสต์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์หลังจากที่โทรโฟซอยต์ส่วนใหญ่ถูกกระตุ้นให้เกิดเป็นซีสต์ ส่วนผสมของการเพาะเลี้ยงก็จะถูกเก็บเกี่ยวและแขวนลอยใหม่ในน้ำปราศจากไอออนที่ปราศจากไอออนเพื่อสลายโทรโฟซอยต์ที่เหลือซีสต์ถูกนับและเก็บไว้ที่ 4°C สำหรับการวิเคราะห์ในภายหลังผ่านท่อย่อยในหนูเมาส์
Giardia extracell vesicles (GEVs) ได้รับการเสริมสมรรถนะตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13]โทรโฟซอยต์ในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึมถูกแขวนลอยอีกครั้งในอาหารเลี้ยงเชื้อ TYI-S-33 ที่ได้รับการดัดแปลงซึ่งเตรียมด้วย FBS ที่พร่องจากภายนอก (อุตสาหกรรมชีวภาพ, Beit-Haemek, อิสราเอล) จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1 × 106 ปรสิต / มล. และบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมงถูกแยกออกจากส่วนลอยตะกอนโดยการปั่นแยกที่ 2000 กรัม เป็นเวลา 10 นาที 10,000 กรัม เป็นเวลา 45 นาที และ 100,000 กรัม เป็นเวลา 60 นาทีตะกอนถูกละลายในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ตรวจปริมาณโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) และเก็บไว้ที่ -80° C หรือใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม
มาโครฟาจทางช่องท้องของหนูปฐมภูมิถูกจัดเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [24]โดยสรุปหนู (อายุ 6-8 สัปดาห์) ถูกฉีด (ทางช่องท้อง [ip]) ด้วย 2.5 มล. ของ 2.98% Difco ของเหลว thioglycol ขนาดกลาง (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) และเลี้ยง 3-4 เพดานปากสารแขวนลอยของมาโครฟาจถูกรวบรวมจากช่องท้องของหนูหลังการการุณยฆาต และปั่นแยก 3 ครั้งที่ 1,000 กรัม เป็นเวลา 10 นาทีเซลล์ที่เก็บเกี่ยวถูกตรวจพบโดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้มาร์กเกอร์ CD11b จนกระทั่งความบริสุทธิ์ของเซลล์คือ >98% จากนั้นเติมไปยังเพลตเพาะเลี้ยงเซลล์ 6 หลุม (4.5 x 106 เซลล์/หลุม) และบ่มด้วย 10% FBS (อุตสาหกรรมชีวภาพ) ที่ 37°Cและคาร์บอนไดออกไซด์ 5%
RNA ถูกสกัดจาก trophozoites 1 × 107 ในรีเอเจนต์ TRIzol 1 มล. (Vazyme, หนานจิง, จีน), DNA จีโนมถูกสกัดจาก G. duodenalis RNA ทั้งหมดโดยใช้ MonScript dsDNase (Monad, หวู่ฮั่น, จีน) และ DNA เสริม (cDNA) ถูกสังเคราะห์ ใช้ MonScript RTIIII Super Mix (Monad) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
ข้อมูลลำดับ CDS สำหรับยีนเป้าหมาย G. duodenalis ได้รับจาก NCBI GenBankใช้ Primer 5.0 เพื่อออกแบบไพรเมอร์การโคลนแบบไร้รอยต่อเฉพาะสำหรับยีนเป้าหมายแต่ละยีนไพรเมอร์ไปข้างหน้า (5′-3′) ประกอบด้วยสามส่วน: ลำดับที่ทับซ้อนกันกับเวกเตอร์เชิงเส้นตรง pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) และเริ่มรหัส ATG และ GNN (หากฐานแรกไม่ใช่ G)ทำเช่นนี้เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของนิพจน์นอกจากนี้ เบสรวมอย่างน้อย 16 bp (ปริมาณ GC 40–60%/Tm ประมาณ 55 °C)ไพรเมอร์ย้อนกลับ (5′-3′) ประกอบด้วยสองส่วน ซึ่งเป็นลำดับที่ทับซ้อนกันกับเวกเตอร์ pcDNA3.1(+) เชิงเส้นตรงของ EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) และฐานรวมกันอย่างน้อย 16 bp(ไม่รวมสองจุดสุดท้าย)เบส) โคดอน เช่น AA หรือ GA เพื่อยอมให้รีคอมบิแนนท์พลาสมิดแสดงออกโปรตีนที่ติดฉลากของพวกมัน)ลำดับไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางที่ 1 และสังเคราะห์โดย Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (ฉางชุน, จีน)
เป้าหมายถูกขยายโดยใช้ Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) หรือ Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) โดยใช้ G. duodenalis cDNA ที่เตรียมไว้เป็นเทมเพลตพลาสมิดเวกเตอร์การแสดงออกยูคาริโอต pcDNA3.1(+) ถูกทำให้เป็นเส้นตรงด้วยเอนไซม์จำกัด EcoRV และดีฟอสโฟรีเลตโดยใช้ Fast AP (Thermo Fisher Scientific)ชิ้นส่วน pcDNA3.1(+) ที่ถูกทำให้เป็นเส้นตรงและชิ้นส่วนของยีนเป้าหมายที่ถูกขยายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเจล DNA (Tiangen) และหาปริมาณโดยใช้ Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific)แฟรกเมนต์ pcDNA3.1(+) และแต่ละส่วนของยีนเป้าหมายถูกรวมตัวกันอีกครั้งโดยใช้การผสมโคลนแบบประกอบเดี่ยวของ MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., ซูโจว, จีน) และยืนยันโดยการจัดลำดับ DNA โดยใช้ Comate Bioscience Company Limited (ฉางชุน, จีน)-
พลาสมิดที่ปราศจากเอนโดท็อกซิน pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ชุดมินิพลาสมิดที่ปราศจากเอนโดท็อกซินของ SanPrep (Sangon Biotech)ความเข้มข้นถูกคงไว้เหนือ 500 นาโนกรัม/ไมโครลิตรเพื่อให้แน่ใจว่า EDTA ในบัฟเฟอร์การชะไม่รบกวนการสอบวิเคราะห์ทรานส์เฟกชันมาโครฟาจทางช่องท้องของหนูปฐมภูมิถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 6 หลุมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 ที่สมบูรณ์ (อุตสาหกรรมชีวภาพ) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้นล้างเซลล์ 3 ครั้งใน PBS อุ่นเพื่อกำจัดเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน และจากนั้นในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์พลาสมิดที่ปราศจากเอนโดท็อกซิน pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ถูกเจือจางใน 125 μl ของ Opti-MEM ลดระดับกลางของซีรั่ม (Gibco, Thermo Fisher Scientific)-จากนั้น 5 ไมโครลิตรของรีเอเจนต์การทรานส์เฟกชันของ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ถูกเจือจางในตัวกลาง Opti-MEM ในซีรั่มต่ำ 125 ไมโครลิตรเตรียมสารเชิงซ้อนของไลโปโซม-DNA โดยการผสมพลาสมิดที่ปราศจากเอนโดท็อกซินเจือจางกับ Lipofectamine 2000 และปล่อยให้ส่วนผสมคงอยู่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีย้ายคอมเพล็กซ์แยกกันไปยังเซลล์ในแต่ละหลุมและผสมช้าๆหลังจาก 4 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเซลล์ถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ RPMI 1640 ที่สมบูรณ์ 2 มิลลิลิตร และการเพาะเลี้ยงถูกดำเนินต่อไปเป็นเวลา 24 ชั่วโมงอาหารเลี้ยงเซลล์สดถูกเติมไปยังเซลล์และบ่มสำหรับจุดเวลาต่างๆ ซึ่งขึ้นอยู่กับการออกแบบการสอบวิเคราะห์
ตัวอย่างโปรตีนจากส่วนลอยเหนือตะกอนและไลซีนของเซลล์ถูกจัดเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25]พารามิเตอร์การถ่ายโอนเมมเบรนสำหรับ pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin และ His-tag คือ 200 mA/90 นาทีสำหรับ interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) และ NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) และ 1:5000 กำหนดเป้าหมายแท็กของเขา (Amylet Scientific, หวู่ฮั่น จีน) และ β-actin (โปรตีนเทค หวู่ฮั่น จีน)
การเชื่อมโยงข้ามกับ disuccinimide suberate (DSS) ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26]เซลล์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS เย็นและสลายอย่างสมบูรณ์ด้วยเข็ม 27 เกจในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา ASC 50 ไมโครลิตร (pH 8.0) ที่ประกอบด้วย 25 มิลลิโมลาร์ Na2PO4, 187.5 มิลลิโมลาร์ NaCl, 25 มิลลิโมลาร์ HEPES และ 125 มิลลิโมลาร์ NaHCO3ของผสมถูกปั่นแยกที่ 5000 กรัม เป็นเวลา 3 นาที และเม็ดถูกเย็บด้วย DSS 10 ไมโครลิตร (25 มิลลิโมลาร์ใน DMSO) และบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา ASC 40 ไมโครลิตร เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37°Cหลังจากการปั่นแยกที่ 5,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาที เม็ดจะถูกละลายในสารละลายบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา ASC 40 µl และบัฟเฟอร์การโหลดโปรตีน 6x 10 µl (TransGen, ปักกิ่ง, จีน) จากนั้นสารละลายถูกระงับที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีแล้วต้มต่ออีก 10 นาทีจากนั้นตัวอย่างโปรตีนจะถูกนำไปซับแบบตะวันตกโดยใช้แอนติบอดีต่อต้าน ASC หลัก (Wanleibio, Shenyang, China) ที่อัตราส่วนเจือจาง 1:500
ปฏิบัติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13] ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและการหลั่งของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ IL-1β ถูกกำหนดโดยใช้ชุดเมาส์ IL-1 Beta ELISA (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)แปลงค่า OD450nm เป็นความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน IL-1β
เซลล์ที่เคลือบบนแผ่นปิดถูกล้างเบา ๆ 3 ครั้งใน PBS อุ่น ๆ แก้ไขในการตรึงเซลล์เนื้อเยื่อ (Biosharp, ปักกิ่ง, จีน) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) ใน 0.1% Triton X-Permeabilize ที่ 100 (เจือจางใน PBS; Biosharp ) เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องและปิดกั้นในซีรั่มอัลบูมินของวัว 5% (ใน PBS) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องจากนั้นเซลล์ถูกบ่มข้ามคืนที่ 4°C ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต้าน ASC (การเจือจาง 1:100) หรือ NLRP3 (การเจือจาง 1:100) ตามลำดับ และ Cy3 ติดฉลาก IgG ต้านกระต่ายของแพะ (H+L) (1:400; EarthOx , ซานฟรานซิสโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) หรือ IgG แพะต้านหนูเมาส์ที่ควบ FITC (1:400; Earthox) ข้ามคืนที่ 37°C ในความมืดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงนิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, ซูโจว, จีน) เป็นเวลา 5 นาทีและสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (Olympus Corporation, โตเกียว, ญี่ปุ่น)
หนูเมาส์ถูกแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม (n = 7 ในแต่ละกลุ่ม): (i) กลุ่มควบคุมเชิงลบที่บำบัดด้วย PBS (PBS เท่านั้น; การให้ยา 100 ไมโครลิตร/PBS ของหนู ตามด้วยการฉีดในช่องท้องรายวัน 100 ไมโครลิตร/PBS ของหนู 3 ชั่วโมงต่อมา)ต่อเนื่องเป็นเวลา 7 วัน);(ii) กลุ่มควบคุมเชิงลบที่บำบัดด้วยตัวยับยั้ง MCC950 [27] (100 ไมโครลิตร/เมาส์ผ่านทางสาย PBS, 3 ชั่วโมงต่อมา, 10 มก./กก. น้ำหนักตัว [BW] MCC950 [ใน PBS] ได้รับการบริหารให้ในช่องท้องทุกวัน ระยะเวลา 7 วัน);(iii) กลุ่มการติดเชื้อซีสต์ของ G. duodenalis (1.5 x 106 ซีสต์/เมาส์โดยสายยาง, 3 ชั่วโมงต่อมา, 100 ไมโครลิตร/เมาส์ PBS บริหารในช่องท้องทุกวันเป็นเวลา 7 วัน);(iv) กลุ่มการติดเชื้อ G. duodenalis cyst รวม กลุ่มการรักษาสารยับยั้ง MCC950 (1.5 × 106 ซีสต์/เมาส์ผ่านทางสายยาง, 10 มก./กก. น้ำหนักตัว MCC950 ทางช่องท้องทุกวันเป็นเวลา 7 วันที่ 3 ชม.)น้ำหนักตัวของหนูแต่ละตัวถูกติดตามทุกวันและหนูทุกตัวถูกการุณยฆาตในวันที่ 7ลำไส้เล็กส่วนต้นที่เก็บเกี่ยว (ยาว 3 ซม.) ถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ ใน PBS ขนาด 1 มิลลิลิตร ซีสต์ถูกทำลายในชั่วข้ามคืนใน PBS ที่ 4°C และ G. duodenalis trophozoitesลำไส้เล็กส่วนต้นสด (ยาว 1 ซม.) ถูกแยกออกสำหรับการย้อมสีฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E)
หนูถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่ม: (i) กลุ่มควบคุม MOCK และ (ii) กลุ่มตัวยับยั้ง MCC950มีการรักษาห้าวิธีในแต่ละกลุ่ม (n = 7/กลุ่มการรักษา): (i) กลุ่มควบคุมเชิงลบการรักษา PBS (PBS เท่านั้น; 100 µl/mouse PBS, การฉีดเข้ากล้ามเนื้อ (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) กลุ่มควบคุมพลาสมิดเชิงลบ (100 ไมโครกรัม/ดีเอ็นเอของหนูเมาส์ ผ่านการฉีดเข้ากล้ามเนื้อ); (iii) กลุ่มควบคุมการติดเชื้อซีสต์ของ G. duodenalis (1.5 x 106 ซีสต์/หนูเมาส์ ผ่านทางสายยาง) (iv) กลุ่มที่บำบัดด้วยพลาสมิด pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 ไมโครกรัม/ดีเอ็นเอของเมาส์ โดยการฉีดเข้ากล้ามเนื้อ) และ (v) กลุ่มที่บำบัดด้วยพลาสมิด pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 ไมโครกรัม/เมาส์) DNA หลังจากผ่านไป 12 ชั่วโมง หนูในกลุ่มตัวยับยั้ง MCC950 ได้รับการฉีด MCC950 ในช่องท้องทุกวัน (10 มก./น้ำหนักตัว 1 กก.) เป็นเวลา 7 วัน ในขณะที่หนูในกลุ่ม MOCK ได้รับการรักษาด้วย PBS ในปริมาณที่เท่ากัน ตัวอย่างเลือด เก็บจากหนูลูกตาและทิ้งไว้ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4 °C แยกตัวอย่างซีรัมโดยใช้การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) และการวัดระดับ IL-1β
หนูสามสิบห้าตัวถูกแบ่งออกเป็นห้ากลุ่ม (n=7/กลุ่ม)กลุ่มที่ 1 เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบที่บำบัดด้วย PBS: หนูได้รับ PBS 100 ไมโครลิตรในกล้ามเนื้อและ 3 วันต่อมาโดยสายยางกลุ่มที่ 2 เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ติดเชื้อซีสต์ G. duodenalis: หนูถูกฉีดด้วย PBS 100 ไมโครลิตร และ 3 วันต่อมา 1.5 x 106 ซีสต์/เมาส์ถูกฉีดเข้าในกระเพาะอาหารกลุ่มที่สาม – การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยพลาสมิดด้วย pcDNA3.1(+) ร่วมกับกลุ่มควบคุมสำหรับการติดเชื้อซีสต์ในลำไส้เล็กส่วนต้น: หนูได้รับพลาสมิด DNA pcDNA3.1(+)(im) 100 ไมโครกรัม ทางปาก, 1.5×106 ซีสต์/เมาส์ 3 สำหรับหลายๆ วันกลุ่มที่ 4 และ 5 คือรีคอมบิแนนท์ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid หรือ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid ร่วมกับการติดเชื้อ G. duodenalis cystกลุ่มทดลอง: หนูได้รับ pcDNA3 100 ไมโครกรัม1(+)-giardine plasmid DNA (im) จากนั้น 3 วันต่อมา 1.5 × 106 ซีสต์/หนูถูกฉีดผ่านทางสายยางน้ำหนักตัวของหนูแต่ละตัวได้รับการตรวจสอบหลังจากการแนะนำถุง G. duodenalis ผ่านท่อลำไส้เล็กส่วนต้นสดถูกรวบรวมสำหรับการวัดภาระของปรสิตและการวิเคราะห์การย้อมสี HE
วิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาตามขั้นตอนที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ [30]ลำไส้เล็กส่วนต้นสดได้รับการแก้ไขด้วยการตรึงเซลล์เนื้อเยื่อฝังในพาราฟินตัดเป็นส่วน 4 μm ย้อมด้วย H&E และวิเคราะห์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาที่เป็นตัวแทนในเนื้อเยื่อเจ็ดส่วนจากหนูอิสระเจ็ดตัวได้รับการประเมินโดยนักพยาธิวิทยาที่ไม่ตระหนักถึงการรักษาและถูกจับที่กำลังขยาย 200 เท่าวัดความยาวของวิลลี่และความลึกของห้องใต้ดินตามวิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
ผลลัพธ์ ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ได้รับเป็นสามเท่ากราฟถูกสร้างขึ้นโดยใช้ GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างสองกลุ่มโดย t-test ในขณะที่ความแตกต่างระหว่างกลุ่ม ≥ 3 กลุ่มถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA)ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์สำหรับความเป็นเนื้อเดียวกันของความแปรปรวนโดยใช้การทดสอบของเลวีน ตามด้วยการทดสอบหลังการทดสอบของ Bonferroni (B)นัยสำคัญแสดงเป็น P<0.05, P<0.01 และ P<0.001 (ไม่มีนัยสำคัญ [ns]) (P>0.05)
การวิเคราะห์ก่อนหน้าของเราเกี่ยวกับโปรตีโอมิกส์ของ GEV ในสารานุกรมยีนและจีโนมของเกียวโต (KEGG) แสดงให้เห็นว่าเป้าหมายจำนวนมากอาจเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณการอักเสบเราเลือกเป้าหมายที่น่าหวังสองเป้าหมาย ได้แก่ alpha-2 และ alpha-7.3 giardins ขยายโมเลกุลเหล่านี้ และใช้พวกมันเพื่อสร้างเวกเตอร์การแสดงออกยูคาริโอต pcDNA3.1(+)หลังจากการหาลำดับ พลาสมิดของการแสดงออกของไกอาร์ดีนชนิดรีคอมบิแนนท์ pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ alpha-7.3 ถูกทรานส์เฟกไปเป็นมาโครฟาจในช่องท้องของหนูเมาส์ปฐมภูมิ และโปรตีนที่เป็นเอกลักษณ์เฉพาะของแคสเพส-1 p20 ของการอักเสบ (ชิ้นส่วนของแคสเพส-1 ที่ถูกกระตุ้น) ถูกระบุ เป็นการชี้แจงโมเลกุลสำคัญที่ทำให้เกิดการอักเสบได้ผลการศึกษาพบว่า giardines ของ alpha-2 และ alpha-7.3 สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ p20 caspase-1 ได้คล้ายกับ GEVไม่มีผลต่อการกระตุ้นแคสเพส-1 ที่พบในกลุ่มควบคุมเชิงลบที่ไม่ได้รับการบำบัด (PBS เท่านั้น) และกลุ่มควบคุมพลาสมิด pcDNA3.1(+) (รูปที่ 1)
การวัดการเปิดใช้งาน p20 caspase-1 โดย pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ alpha-7.3 giardinsพลาสมิดของการแสดงออกยูคาริโอตชนิดลูกผสม pcDNA3.1(+)-อัลฟา-2 และ alpha-7.3 ไจอาร์ดีน (เหนือแต่ละเลน) ถูกทรานส์เฟกไปเป็นมาโครฟาจในช่องท้องปฐมภูมิและส่วนลอยเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงถูกเก็บเกี่ยวใน 24 ชั่วโมงต่อมาเวสเทิร์นบล็อตติงถูกใช้เพื่อวัดระดับการแสดงออกของโปรตีนอินฟลามาโซมแคสเพส-1 p20 อันเป็นเอกลักษณ์กลุ่มการบำบัดด้วย PBS เพียงอย่างเดียว (เลน C) และกลุ่มบำบัดเดี่ยว pcDNA3.1(+) (เลน pcDNA3.1) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ และกลุ่มบำบัด GEV ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกการแสดงออกของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ได้รับการยืนยันโดยการตรวจหาแท็กฮิสทิดีนในโปรตีนแต่ละตัว และแถบโปรตีนที่คาดหวังคืออัลฟา-2 ไกอาร์ดีน (38.2 กิโลดาลตัน) และอัลฟา-7.3 ไกอาร์ดีน (37.2 กิโลดาลตัน)GEV, ถุงนอกเซลล์ Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), เวกเตอร์เชิงเส้นตรง EcoRV, SUP, ส่วนลอยเหนือตะกอน
เพื่อตรวจสอบว่า alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine กระตุ้นการแสดงออกของ p20 caspase-1 และมีบทบาทในการเปิดใช้งานการตอบสนองการอักเสบของโฮสต์ NLRP3, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine และ pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin ถูกแปลงร่างไปเป็นมาโครฟาจในช่องท้องของหนูปฐมภูมิด้วยรีคอมบิแนนท์พลาสมิด DNA และระดับของการแสดงออก การแปลเป็นภาษาท้องถิ่น และโอลิโกเมอไรเซชันของโปรตีนการอักเสบที่สำคัญ NLRP3 ถูกกำหนดในการทดลองนี้ GEV ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก และกลุ่มที่ไม่มีการบำบัด (PBS เท่านั้น) หรือกลุ่มการบำบัดด้วยการทรานส์เฟกชัน pcDNA3.1(+) คือกลุ่มเชิงลบผลการศึกษาพบว่า เช่นเดียวกับในกลุ่ม GEV recombinant plasmid DNA ของ giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 และ giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ส่งผลให้มีการควบคุม NLRP3, pro-IL-1β และ การเปิดใช้งาน procaspase-1 และ caspase-1 (รูปที่ 2a)นอกจากนี้ giardines ทั้งสองยังทำให้เกิดการหลั่ง IL-1βที่มีนัยสำคัญ (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).-อัลฟ่า-7.3 ไกอาร์ดีน: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: การวิเคราะห์ความแปรปรวน, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (รูปที่ 2b)โปรตีน ASC ส่วนใหญ่เป็นโมโนเมอร์ในกลุ่มที่ไม่มีการบำบัดหรือในกลุ่มการบำบัดที่ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิด pcDNA3.1(+) ตรงกันข้ามกับ pcDNA3.1(+)-alpha-2 หรือ pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 จาร์ดีนโอลิโกเมอไรเซชันของ ASC เกิดขึ้นใน DNA พลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ของกลุ่มหรือกลุ่มควบคุมเชิงบวกของ GEV ซึ่งแสดงรูปแบบโอลิโกเมอร์ (รูปที่ 2c)ข้อมูลเบื้องต้นเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า alpha-2 giardine และ alpha-7,3 giardine สามารถกระตุ้นการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 ได้การศึกษาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ในเวลาต่อมาของการแปล ASC และ NLRP3 แสดงให้เห็นว่าในกลุ่มควบคุมเชิงลบ โปรตีน ASC ถูกกระจายไปทั่วไซโตพลาสซึมและปรากฏเป็นสัญญาณจุดเมื่อมีการกระตุ้น pcDNA3.1(+)-alpha-2 ด้วย giardine หรือ pcDNA3หมู่ 1(+)-อัลฟา-7,3 ไกอาร์ดีนหรือกลุ่มควบคุมที่ให้ผลบวกของ GEV (รูปที่ 2d)ในกลุ่มควบคุมเชิงลบและกลุ่ม pcDNA 3.1 ที่บำบัดด้วยพลาสมิด สัญญาณโปรตีน NLRP3 ไม่ถูกตรวจพบ ในขณะที่จุดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เพื่อตอบสนองต่อ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine หรือ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ถูกตรวจพบ-giardine พบได้ในไซโตพลาสซึมหรือจากการกระตุ้นของ HEV (รูปที่ 2e)ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่า G. duodenalis giardin alpha-2 และ giardin alpha-7.3 กระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในมาโครฟาจทางช่องท้องปฐมภูมิของเมาส์
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin และ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin กระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในมาโครฟาจทางช่องท้องของเมาส์แปลงพลาสมิดของการแสดงออกรีคอมบิแนนท์ยูคาริโอต pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin และ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ไปเป็นมาโครฟาจและเซลล์ในช่องท้องของหนูปฐมภูมิ หรือเก็บเกี่ยวส่วนเหนือตะกอนภายใน 24 ชั่วโมงเพื่อวิเคราะห์การแสดงออก โอลิโกเมอไรเซชัน , การหลั่งและการแปลโปรตีนการอักเสบที่สำคัญกลุ่มบำบัดเฉพาะ PBS (C) และกลุ่มบำบัดเดี่ยว pcDNA3.1(+) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ และกลุ่มบำบัด GEV ถูกใช้เป็นกลุ่มบวกตรวจพบโปรตีนอักเสบที่สำคัญ NLRP3 รวมถึง NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 และ p20 caspase-1 ถูกตรวจพบโดย Western blottingb ระดับการหลั่งของ IL-1βใน supernatants ถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA)ความแตกต่างระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มทดลองถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ทางเดียวของความแปรปรวน (ANOVA) โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม **P<0.01 และ ***P<0.001c ระดับโอลิโกเมอไรเซชันของ ASC ในเม็ดถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์การเชื่อมโยงข้าม DSS ในขณะที่ระดับ ASC ในไลเซทของเซลล์ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลดd การแสดงภาพการแปล ISC โดยใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์e อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ถูกใช้เพื่อแสดงภาพการแปล NLRP3ASC โปรตีนคล้ายจุดอะพอพโทติกอิลลินอยส์, อินเตอร์ลิวคิน;NLRP3, ตัวรับคล้ายโอลิโกเมอไรเซชันที่จับกับนิวคลีโอไทด์ 3;ns ไม่มีนัยสำคัญ (P > 0.05)
ทั้ง G. duodenalis และ GEV ที่หลั่งออกมาจะกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome และควบคุมการตอบสนองการอักเสบของโฮสต์ ในหลอดทดลองดังนั้นบทบาทของ NLRP3 ที่ทำให้อักเสบในการเกิดโรคของ G. duodenalis ยังไม่ชัดเจนเพื่อตรวจสอบปัญหานี้ เราได้ออกแบบการทดลองระหว่างหนูที่ติดเชื้อ G. duodenalis cyst และหนูที่ติดเชื้อ G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor treatment และเปรียบเทียบการแสดงออกของ NLRP3 ที่ทำให้เกิดอาการอักเสบเมื่อติดเชื้อ G. duodenalis cystรูปแบบรายละเอียดของการทดลองแสดงในรูปที่ 3aการเปลี่ยนแปลงน้ำหนักตัวของหนูในกลุ่มการรักษาที่แตกต่างกันถูกติดตามเป็นเวลา 7 วันหลังการติดเชื้อซีสต์ และผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 3bเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับ PBS บริสุทธิ์ ผลการวิจัยพบว่า (i) น้ำหนักตัวของหนูที่ติดเชื้อ G. duodenalis cyst ลดลงจากวันที่ 3 ถึงวันที่ 7 หลังการติดเชื้อ;(ii) การรักษาด้วยสารยับยั้ง MCC950 ไม่มีผลกระทบที่มีนัยสำคัญต่อน้ำหนักตัวของหนู-เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มการติดเชื้อเดี่ยว BW ของกลุ่มการติดเชื้อลำไส้เล็กส่วนต้นที่รักษาด้วย MCC950 ลดลงเป็นระดับที่แตกต่างกัน (วันที่ 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; วันที่ 2: ANOVA, F ( 3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; วันที่ 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; วันที่ 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052; วันที่ 5: ANOVA, F (3, 24)=0.6497, P=0.0645; วันที่ 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; วันที่ 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202)ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการอักเสบของ NLRP3 ปกป้องหนูจากการลดน้ำหนักอย่างมีนัยสำคัญในระยะแรก (2-4 วัน) ของการติดเชื้อในลำไส้เล็กส่วนต้นจากนั้นเรามุ่งเป้าที่จะตรวจจับ G. duodenalis trophozoites ในของเหลวล้างลำไส้เล็กส่วนต้น และผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 3cเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มการติดเชื้อถุงน้ำ G. duodenalis จำนวนโทรโฟซอยต์ในลำไส้เล็กส่วนต้นเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการปิดกั้น NLRP3 inflammasome ( t (12) = 2.902, P = 0.0133)เนื้อเยื่อลำไส้เล็กส่วนต้นที่ย้อมด้วย HE แสดงให้เห็นเมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเชิงลบที่รักษาด้วย PBS และ MCC950 เพียงอย่างเดียว: (i) การติดเชื้อถุงน้ำใน G. duodenalis ส่งผลให้เกิดความเสียหายต่อ villi ลำไส้เล็กส่วนต้น (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) และรอยฝ่อฝังศพใต้ถุนโบสถ์ (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) ลำไส้เล็กส่วนต้นจากหนูที่ติดเชื้อ G. duodenalis cysts และรักษาด้วยสารยับยั้ง MCC950วิลไลในลำไส้เล็กได้รับความเสียหายและเสียชีวิต (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) โดยมีฝ่อและกิ่งก้านฝังศพใต้ถุนโบสถ์ (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (รูปที่ 3 มิติ- ฉ) .ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการอักเสบของ NLRP3 มีบทบาทในการลดการเกิดโรคของ G. duodenalis
บทบาทของการอักเสบของ NLRP3 ในการติดเชื้อ Giardia duodenumหนูเมาส์ถูกผ่า (iv) ด้วยซีสต์ดูโอดีโนคอคคัส จากนั้นทำการบำบัดโดยมีหรือไม่มี MCC950 (ip)กลุ่มการบำบัดเดี่ยวที่มี PBS หรือ MCC950 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมกลุ่มทดลองและระบบการรักษาb ติดตามน้ำหนักตัวของหนูในแต่ละกลุ่มการรักษาเป็นเวลา 7 วันวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มการติดเชื้อ G. duodenalis และกลุ่มการรักษาการติดเชื้อ G. duodenalis + MCC950 โดย t-test โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญที่ *P<0.05, **P<0.01 หรือ ***P<0.001c ปริมาณปรสิตถูกกำหนดโดยการนับจำนวนโทรโฟซอยต์ในของเหลวล้างลำไส้เล็กส่วนต้นวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มการติดเชื้อ G. duodenalis และกลุ่มการรักษาการติดเชื้อ G. duodenalis + MCC950 โดย t-test โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่ * P < 0.05d ผลการย้อมสี Hematoxylin และ eosin (H&E) ของจุลพยาธิวิทยาในลำไส้เล็กส่วนต้นลูกศรสีแดงบ่งบอกถึงความเสียหายต่อวิลลี่ ลูกศรสีเขียวบ่งบอกถึงความเสียหายต่อห้องใต้ดินสเกลบาร์: 100 µme, f การวิเคราะห์ทางสถิติของความสูงของวิลลัสในลำไส้เล็กส่วนต้นและความสูงของห้องใต้ดินของเมาส์เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญที่ *P<0.05 และ **P<0.01ผลลัพธ์ที่ได้มาจากการทดลองทางชีววิทยาอิสระ 7 รายการน้ำหนักตัว น้ำหนัก;ig เส้นทางการจัดส่งในกระเพาะอาหารip, เส้นทางการจัดส่งทางช่องท้อง;ns ไม่มีนัยสำคัญ (P > 0.05);PBS, น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต;WT ประเภทไวด์
การหลั่งของ IL-1βเป็นจุดเด่นของการกระตุ้นการอักเสบเพื่อตรวจสอบว่า G. duodenalis alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine เปิดใช้งานโฮสต์ NLRP3 inflammasome ในร่างกาย หรือไม่ เราใช้หนู WT ที่ไม่ได้รับการรักษา (กลุ่มเสแสร้ง) และหนูที่ถูกบล็อก NLRP3 inflammasome ที่ถูกบล็อก (กลุ่มการรักษายับยั้ง MCC950)รูปแบบรายละเอียดของการทดลองแสดงในรูปที่ 4aกลุ่มการทดลองประกอบด้วยหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย PBS, การบำบัดด้วยซีสต์ของ G. duodenalis โดยทางสายยาง, การฉีด pcDNA3.1 ในกล้ามเนื้อ และการฉีดในกล้ามเนื้อของ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine หรือ pcDNA3.1-alpha-7.3 giardineในวันที่ 7 หลังจากการบริหารกล้ามเนื้อของพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ จะมีการเก็บซีรั่มและกำหนดระดับของ IL-1β ในแต่ละกลุ่มดังที่แสดงในรูปที่ 4b ในกลุ่ม MOCK: (i) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม PBS การรักษา pcDNA3.1 ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการหลั่งของ IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998) อย่างไรก็ตาม การหลั่ง IL-β เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มถุงน้ำ G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine และ pcDNA31- การฉีด alpha-7.3 giardine เข้ากล้ามเนื้อทำให้ระดับ IL-1β ในซีรัมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine ทำให้เกิดการหลั่ง IL -1β ในระดับสูงในกลุ่มการฉีดเข้ากล้ามของ pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .เมื่อเปรียบเทียบกับแต่ละกลุ่มในกลุ่มการรักษา MCC950 และกลุ่ม MOCK: (i) ระดับการหลั่ง IL-1β ในกลุ่มควบคุม PBS และกลุ่มควบคุม pcDNA3.1 ลดลงในระดับหนึ่งหลังจากการปิดกั้นตัวยับยั้ง MCC950 แต่ความแตกต่างไม่ได้ มีนัยสำคัญ (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) หลังจากบล็อก MCC950การหลั่ง IL-1β ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่ติดเชื้อ G. duodenalis cyst, กลุ่ม pcDNA3.1-alpha-2 giardine และกลุ่ม pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3.540, P = 0.0164)ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine เป็นสื่อกลางในการกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในร่างกาย
pcDNA3.1(+)-giardines เปิดใช้งานโฮสต์ NLRP3 ทำให้เกิดอาการอักเสบ ในสิ่งมีชีวิตหนูเมาส์ได้รับการก่อภูมิคุ้มกัน (IM) ด้วยพลาสมิดของการแสดงออกรีคอมบิแนนท์ยูคาริโอต pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine หรือ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine และจากนั้นบำบัดด้วย MCC950 (ip; หมู่ MCC950) หรือไม่ (กลุ่มจำลอง ).กลุ่มการบำบัดพลาสมิด PBS หรือ pcDNA3.1(+) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ กลุ่มบำบัดซีสต์ G. duodenalis ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกกลุ่มทดลองและระบบการรักษาb ระดับซีรั่มของ IL-1βในหนูถูกวัดในวันที่ 7 โดยการทดสอบ ELISAความแตกต่างระหว่างกลุ่มในกลุ่ม MOCK ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว และความแตกต่างระหว่างกลุ่ม MOCK และกลุ่ม MCC950 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบทีของซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มการรักษาในกลุ่ม MOCK * P <0.05 และ *** P <0.001;เครื่องหมายดอลลาร์ ($) บ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างแต่ละกลุ่มในกลุ่ม MOCK และกลุ่ม MCC950 ที่ P<0.05ผลลัพธ์ของการทดลองทางชีววิทยาอิสระเจ็ดรายการi, การฉีดเข้ากล้าม, ns ไม่มีนัยสำคัญ (P > 0.05)
ในการตรวจสอบผลของการเปิดใช้งาน alpha-2 และ alpha-7.3 giardine-mediated ของโฮสต์ NLRP3 ที่ทำให้เกิดการอักเสบต่อการติดเชื้อ G. duodenalis เราใช้หนู WT C57BL/6 และฉีด alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardineพลาสมิดถูกฉีดเข้ากล้ามเนื้อหลังจากผ่านไป 3 วันผ่านทางท่อกระเพาะอาหารของถุง G. duodenalis หลังจากนั้นจึงสังเกตหนูเป็นเวลา 7 วันรูปแบบรายละเอียดของการทดลองแสดงในรูปที่ 5aวัดน้ำหนักตัวของหนูแต่ละตัวทุกวัน เก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อลำไส้เล็กส่วนต้นสดในวันที่ 7 หลังจากให้ยาผ่านท่อในกระเพาะอาหาร วัดจำนวนโทรโฟซอยต์ และสังเกตการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาดังแสดงในรูปที่ 5b เมื่อเวลาในการให้อาหารเพิ่มขึ้น BW ของหนูในแต่ละกลุ่มจะค่อยๆ เพิ่มขึ้นMT ของหนูเริ่มลดลงในวันที่ 3 หลังจากได้รับ G. duodenalis cysts ทางช่องกระเพาะ จากนั้นจึงค่อยๆ เพิ่มขึ้นการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 ที่เกิดจากการฉีด alpha-2 giardine และ alpha7.3 giardine เข้ากล้ามเนื้อ ทำให้น้ำหนักลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนู (วันที่ 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 วันที่ 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 วันที่ 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; วันที่ 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 วันที่ 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 ไจอาร์ดีน, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083; วันที่ 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, วันที่ 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, วันที่ 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 วันที่ 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 วันที่ 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, วันที่ 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;วันที่ 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 วันที่ 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001)ประเมินภาระของปรสิตในลำไส้เล็กส่วนต้น (รูปที่ 5c)เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ไม่ได้รับการรักษาและกลุ่มที่ฉีดด้วยเวกเตอร์ pcDNA3.1 เปล่า จำนวนของ G. duodenalis trophozoites ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่ฉีดด้วย α-2 giardine และ α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 ไจอาร์ดีน : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 ไจอาร์ดีน: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001)นอกจากนี้ giardine alfa-7.3 ยังป้องกันในหนูได้ดีกว่า giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081)ผลลัพธ์ของการย้อมสี HE แสดงไว้ในรูปที่5d–fหนูที่ฉีดด้วย alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine มีรอยโรคในเนื้อเยื่อลำไส้เล็กส่วนต้นน้อยลง ซึ่งแสดงออกโดยความเสียหายของวิลลัส เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ฉีดด้วย G. duodenalis และหนูที่ฉีดด้วย G. duodenalis ร่วมกับ pcDNA3 vector .1 Zoom ที่ว่างเปล่า(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 หรือ P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 หรือ P = 0.0055) และลดการฝ่อของฝังศพใต้ถุนโบสถ์ (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 หรือ P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 หรือ P = 0.0191)ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า alpha-2 giardine และ alpha-7,3 giardine ลดการติดเชื้อของ G. duodenalis โดยการเปิดใช้งาน NLRP3 inflammasome ในร่างกาย
บทบาทของ pcDNA3.1(+) -giardins ในการติดเชื้อ G. duodenalisหนูเมาส์ได้รับการสร้างภูมิคุ้มกัน (IM) ด้วยพลาสมิดของการแสดงออกรีคอมบิแนนท์ยูคาริโอต pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine หรือ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine จากนั้นถูกทดสอบด้วย G. duodenalis cysts (ig)กลุ่ม PBS และกลุ่มการบำบัดซีสต์ในลำไส้เล็กส่วนต้น pcDNA3.1(+) + ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ และกลุ่มบำบัดซีสต์ในลำไส้เล็กส่วนต้นถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกกลุ่มทดลองและระบบการรักษาb MT ของหนูในแต่ละกลุ่มการรักษาต่างๆ ได้รับการตรวจสอบเป็นเวลา 7 วันหลังการทดลองเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มในกลุ่ม G. duodenalis และกลุ่ม pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine, * P < 0.05, ** P < 0.01 และ *** P < 0.001;เครื่องหมายดอลลาร์ ($) บ่งบอกถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างแต่ละกลุ่มของ G. duodenalis และกลุ่ม pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 และ $$$P<0.001c ปริมาณปรสิตถูกกำหนดโดยการนับจำนวนโทรโฟซอยต์ในการล้างลำไส้เล็กส่วนต้น 1 มิลลิลิตรจากลำไส้เล็กส่วนต้น (ยาว 3 ซม.) และแสดงเป็นจำนวนปรสิตต่อซม. ของลำไส้เล็กส่วนต้นความแตกต่างระหว่างกลุ่มการติดเชื้อ G. duodenalis, กลุ่ม pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine และกลุ่ม pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญที่ **P<0.01 และ ***P<0.001d การเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาในลำไส้เล็กส่วนต้นลูกศรสีแดงบ่งบอกถึงความเสียหายต่อวิลลี่ ลูกศรสีเขียวบ่งบอกถึงความเสียหายต่อห้องใต้ดินสเกลบาร์: 100 µme, f การวิเคราะห์ทางสถิติของความสูงของวิลลัสในลำไส้เล็กส่วนต้นของเมาส์ (e) และความสูงของฝังศพใต้ถุนโบสถ์ (f)ความแตกต่างระหว่างกลุ่มในรูปที่ 1d ถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 22.0เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญที่ *P<0.05 และ **P<0.01ผลลัพธ์ของการทดลองทางชีววิทยาอิสระเจ็ดรายการns ไม่มีนัยสำคัญ (P > 0.05)
Giardia duodenum เป็นปรสิตในลำไส้ที่รู้จักกันดีของมนุษย์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอื่น ๆ ที่ทำให้เกิดโรค Giardiasisในปี พ.ศ. 2547 ได้มีการรวมโครงการนี้ไว้ในโครงการ WHO Neglected Diseases Initiative เนื่องจากมีความชุกสูงในช่วง 6 ปีที่ผ่านมา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในชุมชนที่มีสถานะทางเศรษฐกิจและสังคมต่ำ [32]ระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติมีบทบาทสำคัญในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อ G. duodenalisมีรายงานว่ามาโครฟาจของเมาส์กลืนกินและฆ่า G. duodenalis โดยการปล่อยกับดักนอกเซลล์ [33]การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่า G. duodenalis ซึ่งเป็นปรสิตนอกเซลล์ที่ไม่รุกราน เปิดใช้งาน p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 และเส้นทางการส่งสัญญาณการอักเสบ NLRP3 ในแมคโครฟาจของเมาส์เพื่อควบคุมการตอบสนองการอักเสบของโฮสต์ และ GEV ที่ปล่อยออกมาอาจปรับปรุงกระบวนการนี้13], 24].อย่างไรก็ตาม PAMPs ที่แน่นอนที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบที่ควบคุมโดย NLRP3 ใน GEV และบทบาทของ NLRP3 inflammasome ใน giardiasis ยังคงต้องมีการอธิบายอย่างชัดเจนเพื่อให้กระจ่างเกี่ยวกับคำถามทั้งสองนี้ เราได้ทำการศึกษานี้
การอักเสบของ NLRP3 ตั้งอยู่ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันและสามารถกระตุ้นได้โดยอนุภาคต่างๆ เช่น ผลึกกรดยูริก สารพิษ แบคทีเรีย ไวรัส และปรสิตในการศึกษาเกี่ยวกับแบคทีเรีย สารพิษได้รับการระบุว่าเป็น PAMP สำคัญที่กระตุ้นเซ็นเซอร์การอักเสบ ซึ่งนำไปสู่การอักเสบและการตายของเซลล์ [34]สารพิษที่มีโครงสร้างหลากหลายบางชนิด เช่น เฮโมไลซินจาก Staphylococcus aureus [35] และ Escherichia coli [36] ฮีโมไลซิน BL (HBL) จากเอนเทอโรทอกซิน (NHE) [37] กระตุ้นให้เกิดการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3การศึกษาเกี่ยวกับไวรัสแสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่มีความรุนแรง เช่น โปรตีนซองจดหมาย SARS-COV-2 (E) [38] และโปรตีน NS5 ของไวรัสซิกา [39] เป็น PAMP ที่สำคัญซึ่งรับรู้โดยตัวรับ NLRP3ในการศึกษาปรสิต มีรายงานว่าปรสิตจำนวนมากมีความเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นการอักเสบของโฮสต์ เช่น Toxoplasma gondii, Trichomonas virginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] และ Leishmania [42]โปรตีนเม็ดหนาแน่น GRA35, GRA42 และ GRA43 ที่เกี่ยวข้องกับความรุนแรงของ Toxoplasma gondii จำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำให้เกิด pyroptosis ใน Lewis rat macrophages [43]นอกจากนี้ การศึกษาเกี่ยวกับโรคลิชมาเนียบางส่วนยังมุ่งเน้นไปที่โมเลกุลแต่ละตัวที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบของ NLRP3 เช่น ไลโปฟอสโฟไกลแคนของปรสิต [44] หรือซิงค์ เมทัลโลโปรตีเอส [45]ในบรรดายีนตระกูล alpha-giardin ที่มีลักษณะคล้ายแอนเน็กซิน นั้น alpha-1 giardin ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเป็นตัวเลือกวัคซีนที่มีศักยภาพในการป้องกัน G. duodenalis ในแบบจำลองเมาส์ [18]ในการศึกษาของเรา เราเลือกปัจจัยความรุนแรงของเชื้อ G. duodenalis alpha-2 และ alpha-7,3 giardines ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของ Giardia แต่มีรายงานค่อนข้างน้อยยีนเป้าหมายทั้งสองนี้ถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ของระบบการแสดงออกยูคาริโอต pcDNA3.1(+) สำหรับการวิเคราะห์การกระตุ้นการอักเสบ
ในแบบจำลองเมาส์ของเรา ชิ้นส่วนแคสเปสที่แยกออกทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายของการกระตุ้นการอักเสบเมื่อกระตุ้น NLRP3 จะโต้ตอบกับ ASC รับสมัคร procaspases และสร้าง caspases ที่ใช้งานอยู่ซึ่งแยก pro-IL-1β และ pro-IL-18 ออกเป็น IL-1β และ IL-18 ที่เป็นผู้ใหญ่ ตามลำดับ -18caspases อักเสบ (caspases-1, -4, -5 และ -11) เป็นตระกูลโปรตีเอสซิสเทอีนที่ได้รับการอนุรักษ์ซึ่งมีความสำคัญต่อการป้องกันโดยธรรมชาติและเกี่ยวข้องกับการอักเสบและการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ [46]Caspase-1 ถูกกระตุ้นโดย Canonical inflammasomes [47] ในขณะที่ caspases-4, -5 และ -11 ถูกแยกออกระหว่างการก่อตัวของ inflammasomes ที่ผิดปกติ [48]ในการศึกษานี้ เราใช้แมคโครฟาจทางช่องท้องของเมาส์เป็นแบบจำลองและตรวจสอบ p20 caspase-1 cleaved caspase-1 เป็นเครื่องหมายของการกระตุ้นการอักเสบของโฮสต์ NLRP3 ในการศึกษาการติดเชื้อ G. duodenalisผลการวิจัยพบว่าอัลฟ่า-ไกอาร์ดินจำนวนมากมีหน้าที่ในการกระตุ้นการอักเสบโดยทั่วไป ซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบโมเลกุลของความรุนแรงที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับแบคทีเรียและไวรัสอย่างไรก็ตาม การศึกษาของเราเป็นเพียงการคัดกรองเบื้องต้น และมีโมเลกุลอื่นๆ ที่สามารถกระตุ้นการอักเสบที่ไม่ใช่คลาสสิกได้ ดังที่การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราพบว่าการอักเสบทั้งแบบคลาสสิกและไม่ใช่คลาสสิกในการติดเชื้อ G. duodenalis [13]เพื่อตรวจสอบว่า p20 caspase-1 ที่สร้างขึ้นมีความเกี่ยวข้องกับ NLRP3 inflammasome หรือไม่ เราได้แปลง alpha-2 และ alpha-7.3 giardins ไปเป็นมาโครฟาจทางช่องท้องของเมาส์เพื่อกำหนดระดับการแสดงออกของโปรตีนของโมเลกุลที่สำคัญและระดับ ASC oligomerization โดยยืนยันว่า α-giardins ทั้งสองเปิดใช้งาน NLRP3 ที่น่ารำคาญผลลัพธ์ของเราแตกต่างเล็กน้อยจาก Manko-Prykhoda และคณะ ซึ่งรายงานว่าการกระตุ้นเซลล์ Caco-2 ด้วย G. muris หรือสายพันธุ์ E. coli EPEC เพียงอย่างเดียวสามารถเพิ่มความเข้มของการเรืองแสงของ NLRP3, ASC และ caspase-1 แม้ว่าจะไม่มีนัยสำคัญ ในขณะที่การ costimulation ของ G. muris และ E. coli ช่วยเพิ่มระดับของโปรตีนทั้งสามชนิดได้อย่างไร [49]ความคลาดเคลื่อนนี้อาจเกิดจากความแตกต่างในการเลือกสายพันธุ์ Giardia เส้นเซลล์ และเซลล์ปฐมภูมินอกจากนี้เรายังทำการทดสอบ ในวิฟ โดยใช้ MCC950 ในหนู WT C57BL/6 ตัวเมียอายุ 5 สัปดาห์ ซึ่งไวต่อ G. duodenalis มากกว่าMCC950 เป็นตัวยับยั้ง NLRP3 โมเลกุลขนาดเล็กที่มีศักยภาพและคัดเลือกมาได้ ซึ่งจะบล็อกการกระตุ้น NLRP3 แบบมาตรฐานและไม่ใช่มาตรฐานที่ความเข้มข้นระดับนาโนโมลาร์MCC950 ยับยั้งการเปิดใช้งาน NLRP3 แต่ไม่ส่งผลต่อการเปิดใช้งานเส้นทางการอักเสบของ AIM2, NLRC4 และ NLRP1 หรือเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR [27]MCC950 บล็อกการเปิดใช้งาน NLRP3 แต่ไม่ยับยั้งการเริ่มต้น NLRP3, K+ efflux, การไหลเข้าของ Ca2+ หรืออันตรกิริยาระหว่าง NLRP3 และ ASCแต่จะยับยั้งการกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 แทนโดยการปิดกั้น ASC oligomerization [27]ดังนั้นเราจึงใช้ MCC950 ในการศึกษา ในสัตว์ทดลอง เพื่อกำหนดบทบาทของ NLRP3 inflammasome หลังการฉีด giardineเปิดใช้งาน caspase-1 p10 จะแยกไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ pro-IL-1βและ pro-IL-18 ออกเป็น IL-1βและ IL-18 ที่เป็นผู้ใหญ่ [50]ในการศึกษานี้ ระดับ IL-1βในซีรั่มในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย giardine โดยมีหรือไม่มี MCC950 ถูกนำมาใช้เป็นตัวบ่งชี้ว่าการอักเสบของ NLRP3 ถูกกระตุ้นหรือไม่ตามที่คาดไว้ การบำบัดด้วย MCC950 ช่วยลดระดับ IL-1β ในซีรั่มอย่างมีนัยสำคัญข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่า G. duodenalis giardin alfa-2 และ giardin alfa-7.3 สามารถกระตุ้นการทำงานของเมาส์ NLRP3 ได้
ข้อมูลสำคัญที่สะสมในช่วงทศวรรษที่ผ่านมาได้แสดงให้เห็นว่า IL-17A เป็นตัวควบคุมหลักของภูมิคุ้มกันต่อ G. muris ทำให้เกิดการส่งสัญญาณของ IL-17RA ผลิตเปปไทด์ต้านจุลชีพ และควบคุมการกระตุ้นการทำงานของส่วนเสริม [51]อย่างไรก็ตาม การติดเชื้อ Giardia เกิดขึ้นบ่อยกว่าในคนหนุ่มสาว และมีรายงานว่าการติดเชื้อ Giardia ในหนูอายุน้อยไม่ได้กระตุ้นการตอบสนองของ IL-17A เพื่อใช้ผลในการป้องกัน [52] กระตุ้นให้นักวิจัยมองหา Giardia ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันชนิดอื่นกลไกของการติดเชื้อพยาธิผู้เขียนการศึกษาล่าสุดรายงานว่า G. muris สามารถกระตุ้นการอักเสบของ NLRP3 โดย E. coli EPEC ซึ่งส่งเสริมการผลิตเปปไทด์ต้านจุลชีพและลดความสามารถในการเกาะติดและจำนวนโทรโฟซอยต์ในลำไส้ ซึ่งช่วยลดความรุนแรงของลำไส้ใหญ่ โรคที่เกิดจากแบคทีเรีย [49]การอักเสบของ NLRP3 เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของโรคต่างๆการศึกษาพบว่า Pseudomonas aeruginosa กระตุ้นการกินอัตโนมัติในแมคโครฟาจเพื่อหลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ และกระบวนการนี้ขึ้นอยู่กับการกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome [53]สำหรับ N. caninum การกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome โดยอาศัยออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาจะจำกัดการจำลองแบบในโฮสต์ ทำให้เป็นเป้าหมายในการรักษา [9]พบว่า Paracoccidioides brasiliensis กระตุ้นให้เกิดการกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในเซลล์ dendritic ที่ได้มาจากไขกระดูกของหนู ส่งผลให้มีการปล่อยไซโตไคน์อักเสบ IL-1β ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการป้องกันโฮสต์ [10]ลิชมาเนียหลายชนิด รวมถึง L. amazonensis, L. major, L. Brazilianiensis และ L. infantum chagasi กระตุ้น NLRP3 และ caspase-1 ที่ขึ้นกับ ASC ในมาโครฟาจ เช่นเดียวกับการติดเชื้อ Leishmaniaการจำลองแบบของปรสิตได้รับการปรับปรุงในหนูที่ขาดยีน NLRP3/ASC/caspase-1 [11]ซัมโบนี และคณะมีรายงานการติดเชื้อ Leishmania เพื่อกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome ในแมคโครฟาจ ซึ่งจำกัดการจำลองแบบของปรสิตในเซลล์ดังนั้น Leishmania อาจยับยั้งการเปิดใช้งาน NLRP3 เพื่อเป็นกลยุทธ์ในการหลีกเลี่ยงในการศึกษาในสัตว์ทดลอง การอักเสบของ NLRP3 มีส่วนช่วยในการกำจัดลิชมาเนีย แต่ไม่ส่งผลกระทบต่อเนื้อเยื่อ [54]ในทางกลับกัน ในการศึกษาโรคหนอนพยาธิ การกระตุ้นการทำงานของ NLRP3 inflammasome จะระงับภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อโรคหนอนพยาธิในทางเดินอาหาร [12]Shigella เป็นหนึ่งในแบคทีเรียหลักที่ทำให้เกิดอาการท้องร่วงทั่วโลกแบคทีเรียเหล่านี้สามารถกระตุ้นการผลิต IL-1β ผ่านทางการไหลออกของ K+ ที่เป็นสื่อกลางของตัวรับ P2X7, ชนิดออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยา, การทำให้เป็นกรดของไลโซโซม และความเสียหายของไมโตคอนเดรียการอักเสบของ NLRP3 ควบคุม phagocytosis ในทางลบและกิจกรรมฆ่าเชื้อแบคทีเรียของแมคโครฟาจต่อ Shigella [55]การศึกษาพลาสโมเดียมแสดงให้เห็นว่าหนูที่ขาด AIM2, NLRP3 หรือ caspase-1 ที่ติดเชื้อพลาสโมเดียมจะผลิตอินเตอร์เฟอรอนประเภท 1 ในระดับสูงและมีความทนทานต่อการติดเชื้อพลาสโมเดียมมากกว่า [56]อย่างไรก็ตามบทบาทของ alpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine ในการกระตุ้นให้เกิดการอักเสบของ NLRP3 ในหนูยังไม่ชัดเจน
ในการศึกษานี้ การยับยั้ง NLRP3 inflammasome โดย MCC950 ช่วยลด BW และเพิ่มจำนวนโทรโฟซอยต์ในน้ำล้างลำไส้ในหนู ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสภาพที่รุนแรงยิ่งขึ้นในเนื้อเยื่อลำไส้เล็กส่วนต้นAlpha-2 giardine และ alpha-7.3 giardine กระตุ้นการทำงานของเมาส์โฮสต์ NLRP3 ทำให้เกิดอาการอักเสบ เพิ่มน้ำหนักตัวของเมาส์ ลดจำนวนโทรโฟซอยต์ในน้ำล้างลำไส้ และบรรเทารอยโรคในลำไส้เล็กส่วนต้นทางพยาธิวิทยาผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า G. duodenalis สามารถกระตุ้นโฮสต์ NLRP3 ทำให้เกิดอาการอักเสบผ่านทาง alpha-2 giardine และ alpha-7,3 giardine ซึ่งช่วยลดการเกิดโรคของ G. duodenalis ในหนูเมาส์
โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า alpha-2 และ alpha-7.3 giardines กระตุ้นการทำงานของโฮสต์ NLRP3 ทำให้เกิดอาการอักเสบและลดการติดเชื้อของ G. duodenalis ในหนูดังนั้นโมเลกุลเหล่านี้จึงเป็นเป้าหมายที่มีแนวโน้มในการป้องกันโรคที่เกิดจากเชื้อ Giardiasis
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
เหลียง AKS, เหลียง AAM, หวง AHC, เซอร์กี KM, คัม เจเคเอ็มGiardiasis: ภาพรวมล่าสุดเผยว่า แพท อินแฟลมม์ แพ้ยา2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: การทบทวนเภสัชบำบัดความคิดเห็นของผู้เชี่ยวชาญของเภสัชกร2550;8: 1885–902.
เทียน ฮวาเฟิง, เฉิน ปิน, เหวิน เจี้ยนเฟิงGiardiasis การดื้อยา และการค้นพบเป้าหมายใหม่ติดเชื้อเป้าหมายยา Disord2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T ฯลฯ NLRP3 โรคอักเสบและอักเสบOxide Med Cell Longev2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. บทบาทของการอักเสบในลำไส้อักเสบและมะเร็งระบบทางเดินอาหาร.2554;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. การเปิดใช้งานการอักเสบของ NLRP3 ที่เป็นที่ยอมรับและผิดปรกติที่ทางแยกของความอดทนของภูมิคุ้มกันและการอักเสบของลำไส้ก่อนภูมิคุ้มกัน2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, และคณะการเปิดใช้งานการอักเสบ NLRP3 ที่ใช้สื่อกลาง ROS เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการติดเชื้อ N. caninumเวกเตอร์ปรสิต2020;13:449.