ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะเรนเดอร์ไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
Toxoplasma gondii เป็นปรสิตโปรโตซัวในเซลล์ที่ปรับเปลี่ยนสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคของโฮสต์ที่ติดเชื้อ และเป็นที่ทราบกันว่ามีความเกี่ยวข้องกับอุบัติการณ์ของการเติบโตของเนื้องอกในสมองในการศึกษานี้ เราตั้งสมมติฐานว่า exosomal miRNA-21 จากการติดเชื้อ Toxoplasma ส่งเสริมการเติบโตของเนื้องอกในสมองExosomes จาก BV2 microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma มีลักษณะเฉพาะและการยืนยันภายในของเซลล์ U87 glioma ได้รับการยืนยันวิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออก Exosomal microRNA โดยใช้อาร์เรย์ของ microRNA และ microRNA-21A-5p ที่เกี่ยวข้องกับ Toxoplasma gondii และการคัดแยกเนื้องอกนอกจากนี้เรายังตรวจสอบระดับ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกในเซลล์ U87 glioma โดยการเปลี่ยนระดับ miR-21 ใน exosomes และผลของ exosomes ต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ U87 glioma ของมนุษย์ใน exosomes ของเซลล์ U87 glioma ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii การแสดงออกของ microRNA-21 จะเพิ่มขึ้น และกิจกรรมของยีนต่อต้านเนื้องอก (FoxO1, PTEN และ PDCD4) จะลดลงexosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ทำให้เกิดการแพร่กระจายของเซลล์ U87 gliomaExosomes กระตุ้นการเจริญเติบโตของเซลล์ U87 ในรูปแบบเนื้องอกของหนูเราแนะนำว่าการเพิ่ม exosomal miR-21 ใน microglia BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma อาจมีบทบาทสำคัญในในฐานะโปรโมเตอร์การเจริญเติบโตของเซลล์ในเซลล์ U87 glioma โดยการลดยีนต่อต้านเนื้องอก
มีการประมาณการว่ามีผู้ป่วยมะเร็งระยะลุกลามมากกว่า 18.1 ล้านรายได้รับการวินิจฉัยทั่วโลกในปี 2561 โดยมีการวินิจฉัยเนื้องอกในระบบประสาทส่วนกลางประมาณ 297,000 รายในแต่ละปี (1.6% ของเนื้องอกทั้งหมด)1การวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าปัจจัยเสี่ยงในการพัฒนาเนื้องอกในสมองของมนุษย์ ได้แก่ ผลิตภัณฑ์เคมีต่างๆ ประวัติครอบครัว และรังสีไอออไนซ์จากอุปกรณ์การรักษาและวินิจฉัยศีรษะอย่างไรก็ตาม ยังไม่ทราบสาเหตุที่แท้จริงของมะเร็งเหล่านี้ประมาณ 20% ของมะเร็งทั่วโลกมีสาเหตุจากการติดเชื้อ รวมถึงไวรัส แบคทีเรีย และปรสิต3,4เชื้อโรคที่ติดเชื้อรบกวนกลไกทางพันธุกรรมของเซลล์เจ้าบ้าน เช่น การซ่อมแซม DNA และวัฏจักรของเซลล์ และอาจนำไปสู่การอักเสบเรื้อรังและความเสียหายต่อระบบภูมิคุ้มกัน
สารติดเชื้อที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งในมนุษย์คือเชื้อโรคไวรัสที่พบบ่อยที่สุด รวมถึงไวรัส papillomaviruses ในมนุษย์และไวรัสตับอักเสบบีและซีปรสิตยังสามารถมีบทบาทในการพัฒนามะเร็งของมนุษย์ได้ปรสิตหลายชนิด ได้แก่ Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis และ Hymenolepis nana มีส่วนเกี่ยวข้องกับมะเร็งหลายประเภทในมนุษย์ 6,7,8
Toxoplasma gondii เป็นโปรโตซัวในเซลล์ที่ควบคุมสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคของเซลล์เจ้าบ้านที่ติดเชื้อปรสิตนี้คาดว่าจะแพร่เชื้อได้ประมาณ 30% ของประชากรโลก ส่งผลให้ประชากรทั้งหมดตกอยู่ในความเสี่ยง9,10Toxoplasma gondii สามารถแพร่เชื้อไปยังอวัยวะสำคัญ รวมถึงระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) และทำให้เกิดอาการเจ็บป่วยร้ายแรง เช่น เยื่อหุ้มสมองอักเสบถึงแก่ชีวิตและไข้สมองอักเสบ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง9อย่างไรก็ตาม Toxoplasma gondii ยังสามารถเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมของโฮสต์ที่ติดเชื้อโดยการปรับการเติบโตของเซลล์และการตอบสนองของภูมิคุ้มกันในบุคคลที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง ซึ่งนำไปสู่การคงไว้ของการติดเชื้อเรื้อรังที่ไม่มีอาการที่น่าสนใจเมื่อพิจารณาความสัมพันธ์ระหว่างความชุกของ T. gondii และอุบัติการณ์ของเนื้องอกในสมอง รายงานบางฉบับชี้ให้เห็นว่า การเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมของโฮสต์ ในวิฟ เนื่องจากการติดเชื้อ T. gondii เรื้อรัง มีลักษณะคล้ายกับสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก
เอ็กโซโซมเป็นที่รู้จักในฐานะเครื่องมือสื่อสารระหว่างเซลล์ที่ส่งเนื้อหาทางชีวภาพ รวมถึงโปรตีนและกรดนิวคลีอิกจากเซลล์ข้างเคียง16,17เอ็กโซโซมสามารถมีอิทธิพลต่อกระบวนการทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เช่น การต่อต้านการตายของเซลล์ การสร้างเส้นเลือดใหม่ และการแพร่กระจายในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกโดยเฉพาะอย่างยิ่ง miRNAs (miRNAs) ซึ่งเป็น RNA ขนาดเล็กที่ไม่มีการเข้ารหัสซึ่งมีความยาวประมาณ 22 นิวคลีโอไทด์ เป็นตัวควบคุมยีนหลังการถอดรหัสที่สำคัญ ซึ่งควบคุม mRNA ของมนุษย์มากกว่า 30% ผ่านทาง miRNA-duced silencing complex (miRISC)Toxoplasma gondii สามารถขัดขวางกระบวนการทางชีวภาพโดยการควบคุมการแสดงออกของ miRNA ในโฮสต์ที่ติดเชื้อmiRNA ของโฮสต์มีสัญญาณที่สำคัญในการควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาของโฮสต์เพื่อให้บรรลุกลยุทธ์การเอาชีวิตรอดของปรสิตดังนั้น การศึกษาการเปลี่ยนแปลงโปรไฟล์ miRNA ของโฮสต์จากการติดเชื้อ T. gondii สามารถช่วยให้เราเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และ T. gondii ได้ชัดเจนยิ่งขึ้นแท้จริงแล้ว Thirugnanam และคณะ15 แนะนำว่า T. gondii ส่งเสริมการก่อมะเร็งในสมองโดยการเปลี่ยนการแสดงออกของมันบน miRNA ของโฮสต์จำเพาะที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตของเนื้องอก และพบว่า T. gondii สามารถทำให้เกิดไกลโอมาในสัตว์ทดลองได้
การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนแปลงของ exosomal miR-21 ใน microglia ที่เป็นโฮสต์ที่ติดเชื้อ Toxoplasma BV2เราสังเกตบทบาทที่เป็นไปได้ของการเปลี่ยนแปลง exosomal miR-21 ในการเจริญเติบโตของเซลล์ U87 glioma เนื่องจากการกักเก็บในนิวเคลียสของ FoxO1 / p27 ซึ่งเป็นเป้าหมายของ miR-21 ที่แสดงออกมากเกินไป
ได้รับเอ็กโซโซมที่ได้จาก BV2 โดยใช้การหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียลและตรวจสอบความถูกต้องโดยวิธีการต่างๆ เพื่อป้องกันการปนเปื้อนกับส่วนประกอบของเซลล์หรือถุงอื่นๆSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) แสดงรูปแบบที่แตกต่างกันระหว่างโปรตีนที่สกัดจากเซลล์ BV2 และ exosome (รูปที่ 1A) และตัวอย่างได้รับการประเมินสำหรับการมีอยู่ของ Alix ซึ่งวิเคราะห์โดยการซับแบบตะวันตกของเครื่องหมายโปรตีน exosomal ในพบการติดฉลาก Alix ในโปรตีน exosome แต่ไม่พบในโปรตีน lysate ของเซลล์ BV2 (รูปที่ 1B)นอกจากนี้ วิเคราะห์ RNA บริสุทธิ์จากเอ็กโซโซมที่ได้จาก BV2 โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพหน่วยย่อยไรโบโซม 18S และ 28S ไม่ค่อยถูกสังเกตในรูปแบบการย้ายถิ่น RNA ของ exosomal ซึ่งบ่งบอกถึงความบริสุทธิ์ที่เชื่อถือได้ (รูปที่ 1C)ในที่สุด กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเอ็กโซโซมที่สังเกตได้มีขนาดประมาณ 60–150 นาโนเมตร และมีโครงสร้างคล้ายถ้วยตามแบบฉบับของสัณฐานวิทยาภายนอก (รูปที่ 1D)
การศึกษาลักษณะของเอ็กโซโซมที่ได้มาจากเซลล์ BV2(A) หน้าเอกสารข้อมูลความปลอดภัยโปรตีนถูกแยกออกจากเซลล์ BV2 หรือเอ็กโซโซมที่ได้มาจาก BV2รูปแบบโปรตีนระหว่างเซลล์และเอ็กโซโซมแตกต่างกัน(B) การวิเคราะห์ Western blot ของเครื่องหมาย exosomal (Alix)(C) การประเมิน RNA บริสุทธิ์จากเซลล์ BV2 และ exosome ที่ได้มาจาก BV2 โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ชีวภาพดังนั้นหน่วยย่อยไรโบโซม 18S และ 28S ในเซลล์ BV2 จึงไม่ค่อยพบใน exosomal RNA(D) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเอ็กโซโซมที่แยกได้จากเซลล์ BV2 มีคราบยูรานิลอะซิเตต 2% ในทางลบเอ็กโซโซมมีขนาดประมาณ 60-150 นาโนเมตรและมีรูปร่างคล้ายถ้วย (ซองและจุง ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่)
การตรวจสอบการทำให้เซลล์ภายในของ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 เข้าไปในเซลล์ Glioma ของมนุษย์ U87 นั้นถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเอ็กโซโซมที่มีป้ายกำกับ PKH26 นั้นถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไซโตพลาสซึมของเซลล์ U87นิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI (รูปที่ 2A) ซึ่งบ่งชี้ว่า exosomes ที่ได้มาจาก BV2 สามารถถูกทำให้อยู่ภายในโดยเซลล์โฮสต์และมีอิทธิพลต่อสภาพแวดล้อมของเซลล์ผู้รับ
การทำให้ exosome ที่ได้มาจาก BV2 เข้าไปในเซลล์ U87 glioma และ exosome ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH ทำให้เกิดการแพร่กระจายของเซลล์ U87 glioma(A) Exosomes ที่ถูกกลืนโดยเซลล์ U87 วัดด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเซลล์ไกลโอมา U87 ถูกบ่มด้วยเอ็กโซโซมที่มีป้ายกำกับ PKH26 (สีแดง) หรือไม่มีการควบคุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงนิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI (สีน้ำเงิน) จากนั้นสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (แถบมาตราส่วน: 10 μm, x 3000)(B) การเพิ่มจำนวนเซลล์ U87 glioma ถูกกำหนดโดยการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์เซลล์ U87 glioma ได้รับการบำบัดด้วย exosomes ตามเวลาที่ระบุ *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0.05 โดยการทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *พี < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้รับจากการทดสอบของนักเรียน
หลังจากยืนยันการทำให้อยู่ภายในของ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ในเซลล์ U87 glioma เราได้ทำการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์เพื่อตรวจสอบบทบาทของ exosomes ที่ได้มาจาก Toxoplasma ที่ได้มาจาก BV2 ในการพัฒนาเซลล์ glioma ของมนุษย์การรักษาเซลล์ U87 ด้วย exosome จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii แสดงให้เห็นว่า exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii ทำให้การแพร่กระจายของเซลล์ U87 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2B)
นอกจากนี้ การเติบโตของเซลล์ U118 ให้ผลลัพธ์เช่นเดียวกับ U87 เนื่องจาก Toxoplasma กระตุ้นเอ็กโซโซมทำให้เกิดการแพร่กระจายในระดับสูงสุด (ไม่แสดงข้อมูล)จากข้อมูลเหล่านี้ เราสามารถระบุได้ว่า exosomes ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ที่ได้มาจาก BV2 มีบทบาทสำคัญในการเพิ่มจำนวนเซลล์ glioma
ในการตรวจสอบผลกระทบของ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ต่อการพัฒนาของเนื้องอก เราได้ฉีดเซลล์ glioma U87 เข้าไปในหนูเปลือยสำหรับแบบจำลอง xenograft และฉีด exosomes ที่ได้มาจาก BV2 หรือ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ RHหลังจากเนื้องอกปรากฏชัดเจนหลังผ่านไป 1 สัปดาห์ แต่ละกลุ่มทดลองที่มีหนู 5 ตัวถูกแบ่งตามขนาดของเนื้องอกเพื่อกำหนดจุดเริ่มต้นที่เหมือนกัน และขนาดเนื้องอกถูกวัดเป็นเวลา 22 วัน
ในหนูที่มีแบบจำลองซีโนกราฟต์ U87 พบว่าขนาดและน้ำหนักของเนื้องอกมีขนาดใหญ่ขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม exosome ที่ติดเชื้อ RH ที่ได้มาจาก BV2 ในวันที่ 22 (รูปที่ 3A, B)ในทางกลับกัน ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในขนาดเนื้องอกระหว่างกลุ่ม exosome ที่ได้มาจาก BV2 และกลุ่มควบคุมหลังการรักษา exosomeนอกจากนี้หนูที่ถูกฉีดด้วยเซลล์ glioma และ exosomes ยังแสดงปริมาตรเนื้องอกที่ใหญ่ที่สุดในกลุ่มของ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ RH (รูปที่ 3C)ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า exosomes ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ที่ได้มาจาก BV2 ทำให้เกิดการเติบโตของ glioma ในรูปแบบเนื้องอกของเมาส์
Oncogenesis (AC) ของ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ในแบบจำลองเมาส์ซีโนกราฟต์ U87ขนาดเนื้องอก (A) และน้ำหนัก (B) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูเปลือย BALB/c ที่รับการรักษาด้วย exosomes ที่ติดเชื้อ RH ที่ได้มาจาก BV2หนูเปลือย BALB/c (C) ถูกฉีดใต้ผิวหนังด้วยเซลล์ U87 1 x 107 ที่แขวนลอยอยู่ในของผสมมาทริเจลหกวันหลังการฉีด exosomes ที่ได้มาจาก BV2 100 ไมโครกรัมจะถูกบำบัดในหนูวัดขนาดและน้ำหนักของเนื้องอกในวันที่ระบุและหลังการผ่าตัดตามลำดับ *พี < 0.05 *พี < 0.05 *Р < 0,05. *พี < 0.05 *พี < 0.05。 *พี < 0.05。 *Р < 0,05. *พี < 0.05
ข้อมูลแสดงให้เห็นว่า 37 miRNAs (16 แสดงออกมากเกินไปและ 21 แสดงออก) ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันหรือการพัฒนาของเนื้องอกมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน microglia หลังจากการติดเชื้อสายพันธุ์ Toxoplasma RH (รูปที่ 4A)ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miR-21 ใน miRNA ที่เปลี่ยนแปลงได้รับการยืนยันโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ใน exosomes ที่ได้มาจาก BV2, exosomes ที่รักษาด้วยเซลล์ BV2 และ U87การแสดงออกของ miR-21 แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ exosomes จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ RH) (รูปที่ 4B)ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miR-21 ในเซลล์ BV2 และ U87 เพิ่มขึ้นหลังจากการดูดซึมของ exosomes ที่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 4B)ระดับสัมพัทธ์ของการแสดงออกของ miR-21 ในเนื้อเยื่อสมองของผู้ป่วยเนื้องอกและหนูที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ ME49) สูงกว่าในกลุ่มควบคุมตามลำดับ (รูปที่ 4C)ผลลัพธ์เหล่านี้มีความสัมพันธ์กับความแตกต่างระหว่างระดับการแสดงออกของ microRNA ที่คาดการณ์และได้รับการยืนยัน ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย
การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ exosomal miP-21a-5p ใน microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (RH)(A) แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใน siRNA ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันหรือการพัฒนาของเนื้องอกหลังการติดเชื้อ T. gondii RH( B ) ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ miR-21 ถูกตรวจพบโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ใน exosomes ที่ได้มาจาก BV2, exosomes ที่ได้รับ BV2 และเซลล์ U87( C ) พบระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ miR-21 ในเนื้อเยื่อสมองของผู้ป่วยเนื้องอก ( N = 3) และหนูที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ ME49) ( N = 3) *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *พี < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้รับจากการทดสอบของนักเรียน
Exosomes จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ RH นำไปสู่การเติบโตของ gliomas ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง (รูปที่ 2, 3)ในการตรวจจับ mRNA ที่เกี่ยวข้อง เราได้ตรวจสอบระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายต่อต้านเนื้องอก, กล่อง forkhead O1 (FoxO1), PTEN และการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ 4 (PDCD4) ในเซลล์ U87 ที่ติดเชื้อ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 หรือ RH BV2การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศแสดงให้เห็นว่ายีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกหลายชนิด รวมถึงยีน FoxO1, PTEN และ PDCD4 มีตำแหน่งที่มีผลผูกพัน miR-2121,22ระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายต่อต้านเนื้องอกลดลงใน exosome ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ RH เมื่อเปรียบเทียบกับ exosome ที่ได้มาจาก BV2 (รูปที่ 5A)FoxO1 แสดงระดับโปรตีนที่ลดลงในเอ็กโซโซมที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ RH เมื่อเปรียบเทียบกับเอ็กโซโซมที่ได้มาจาก BV2 (รูปที่ 5B)จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราสามารถยืนยันได้ว่า exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ RH จะควบคุมยีนต่อต้านมะเร็ง โดยรักษาบทบาทในการเจริญเติบโตของเนื้องอก
เอ็กโซโซมที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH ทำให้เกิดการยับยั้งยีนต้านมะเร็งในเซลล์ glioma U87 โดย exosome ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH( A ) PCR แบบเรียลไทม์ของการแสดงออกของ FoxO1, PTEN และ PDCD4 ใน exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii RH เมื่อเปรียบเทียบกับ PBS exosomesmRNA β-actin ถูกใช้เป็นตัวควบคุม( B ) การแสดงออกของ FoxO1 ถูกกำหนดโดย Western blotting และข้อมูลความหนาแน่นได้รับการประเมินทางสถิติโดยใช้โปรแกรม ImageJ *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *พี < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้รับจากการทดสอบของนักเรียน
เพื่อให้เข้าใจถึงผลกระทบของ miP-21 ในเอ็กโซโซมต่อการควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เซลล์ U87 ได้รับการเปลี่ยนถ่ายด้วยสารยับยั้ง miP-21 โดยใช้ Lipofectamine 2000 และเซลล์จะถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่ายระดับการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 ในเซลล์ที่ถูกถ่ายด้วยสารยับยั้ง miR-21 ถูกเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ได้รับ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 โดยใช้ qRT-PCR (รูปที่ 6A, B)การเปลี่ยนถ่ายตัวยับยั้ง miR-21 ไปเป็นเซลล์ U87 ลดการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6)
miP-21 จาก exosomal BV2 ที่ติดเชื้อ RH เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ FoxO1 / p27 ในเซลล์ U87 gliomaเซลล์ U87 ถูกทรานส์เฟกด้วยสารยับยั้ง miP-21 โดยใช้ไลโปเฟคตามีน 2000 และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชันระดับการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 ในเซลล์ที่ถูกถ่ายด้วยสารยับยั้ง miR-21 ถูกเปรียบเทียบกับระดับในเซลล์ที่รักษาด้วย exosomes ที่ได้มาจาก BV2 โดยใช้ qRT-PCR (A, B)
เพื่อหลีกเลี่ยงการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ ปรสิต Toxoplasma จะกลายเป็นถุงน้ำในเนื้อเยื่อพวกมันพยาธิในเนื้อเยื่อต่างๆ รวมถึงสมอง หัวใจ และกล้ามเนื้อโครงร่าง ตลอดอายุขัยของโฮสต์ และปรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์นอกจากนี้ พวกมันสามารถควบคุมวัฏจักรของเซลล์และการตายของเซลล์เจ้าบ้านได้ ซึ่งส่งเสริมการแพร่กระจายของพวกมัน14,24Toxoplasma gondii ติดเชื้อในเซลล์เดนไดรต์ นิวโทรฟิล และเชื้อสายโมโนไซต์/มาโครฟาจเป็นส่วนใหญ่ รวมถึงไมโครเกลียในสมองToxoplasma gondii ทำให้เกิดความแตกต่างของมาโครฟาจของฟีโนไทป์ M2 ส่งผลต่อการหายของบาดแผลหลังการติดเชื้อจากเชื้อโรค และยังสัมพันธ์กับภาวะหลอดเลือดหนาเกินและการเกิดพังผืดของเม็ดเลือดการเกิดพฤติกรรมของการติดเชื้อ Toxoplasma นี้อาจเกี่ยวข้องกับเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของเนื้องอกสภาพแวดล้อมที่ไม่เป็นมิตรซึ่งควบคุมโดย Toxoplasma อาจมีลักษณะคล้ายกับพรีมะเร็งที่เกี่ยวข้องดังนั้นจึงสันนิษฐานได้ว่าการติดเชื้อ Toxoplasma น่าจะมีส่วนทำให้เกิดการพัฒนาของเนื้องอกในสมองในความเป็นจริง มีรายงานอัตราการติดเชื้อ Toxoplasma สูงในซีรั่มของผู้ป่วยที่มีเนื้องอกในสมองหลายชนิดนอกจากนี้ Toxoplasma gondii อาจเป็นสารก่อมะเร็งอีกชนิดหนึ่งและออกฤทธิ์เสริมฤทธิ์กันเพื่อช่วยให้สารก่อมะเร็งที่ติดเชื้ออื่นๆ พัฒนาเนื้องอกในสมองในเรื่องนี้เป็นที่น่าสังเกตว่าไวรัส P. falciparum และ Epstein-Barr มีส่วนช่วยในการสร้างมะเร็งต่อมน้ำเหลืองของ Burkitt
บทบาทของเอ็กโซโซมในฐานะตัวควบคุมในด้านการวิจัยโรคมะเร็งได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวางอย่างไรก็ตาม บทบาทของ exosome ระหว่างปรสิตและโฮสต์ที่ติดเชื้อยังไม่เป็นที่เข้าใจจนถึงขณะนี้ หน่วยงานกำกับดูแลต่างๆ รวมถึงโปรตีนที่หลั่งออกมา ได้อธิบายกระบวนการทางชีววิทยาที่ปรสิตโปรโตซัวต้านทานการโจมตีของโฮสต์และทำให้การติดเชื้อดำเนินต่อไปเมื่อเร็ว ๆ นี้ มีแนวคิดที่กำลังเติบโตว่า microvesicles ที่เกี่ยวข้องกับโปรโตซัวและ microRNA ของพวกมันมีปฏิกิริยากับเซลล์เจ้าบ้านเพื่อสร้างสภาพแวดล้อมที่เอื้ออำนวยต่อการอยู่รอดของพวกมันดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อค้นหาความสัมพันธ์ระหว่าง miRNAs จาก exosomal ที่เปลี่ยนแปลงไปและการเพิ่มจำนวนเซลล์ gliomaการเปลี่ยนแปลง MicroRNA (ยีนคลัสเตอร์ miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 และ miR-17-92) เชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์ STAT3 ในมาโครฟาจของมนุษย์ที่ติดเชื้อ toxoplasma ได้รับการควบคุมและชักนำให้เกิดการต่อต้าน -การตายของเซลล์ในการตอบสนองต่อการติดเชื้อ Toxoplasma gondii 29การติดเชื้อ Toxoplasma เพิ่มการแสดงออกของ miR-17-5p และ miR-106b-5p ซึ่งเกี่ยวข้องกับโรคที่มีการแพร่กระจายมากเกินไป 30ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโฮสต์ miRNA ที่ควบคุมโดยการติดเชื้อ Toxoplasma เป็นโมเลกุลที่สำคัญสำหรับการอยู่รอดของปรสิตและการเกิดโรคในพฤติกรรมทางชีววิทยาของโฮสต์
miRNA ที่ถูกเปลี่ยนแปลงสามารถมีอิทธิพลต่อพฤติกรรมประเภทต่างๆ ในระหว่างการเริ่มต้นและการลุกลามของเซลล์มะเร็ง รวมถึงไกลโอมา: ความเพียงพอของสัญญาณการเติบโตในตนเอง การไม่รู้สึกไวต่อสัญญาณที่ยับยั้งการเจริญเติบโต การหลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ ศักยภาพในการจำลองแบบไม่จำกัด การสร้างเส้นเลือดใหม่ การบุกรุกและการแพร่กระจาย และการอักเสบใน glioma มีการระบุ miRNA ที่เปลี่ยนแปลงในการศึกษาโปรไฟล์การแสดงออกหลายครั้ง
ในการศึกษาครั้งนี้ เรายืนยันการแสดงออกของ miRNA-21 ในระดับสูงในเซลล์เจ้าบ้านที่ติดเชื้อทอกโซพลาสมาmiR-21 ได้รับการระบุว่าเป็นหนึ่งใน microRNA ที่แสดงออกมากเกินไปบ่อยที่สุดในเนื้องอกที่เป็นของแข็ง รวมถึง gliomas, 33 และการแสดงออกของมันสัมพันธ์กับระดับของ gliomaหลักฐานที่สะสมแสดงให้เห็นว่า miR-21 เป็นยีนก่อมะเร็งชนิดใหม่ที่ทำหน้าที่เป็นปัจจัยต่อต้านการตายของเซลล์ในการเจริญเติบโตของ glioma และมีการแสดงออกมากเกินไปในเนื้อเยื่อและพลาสมาของมะเร็งสมองของมนุษย์สิ่งที่น่าสนใจคือการปิดใช้งาน miR-21 ในเซลล์และเนื้อเยื่อ glioma ทำให้เกิดการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์เนื่องจากการตายของเซลล์ที่ขึ้นกับแคสเปสการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของเป้าหมายที่คาดการณ์ไว้ของ miR-21 เผยให้เห็นยีนต้านเนื้องอกหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับวิถีการตายของเซลล์ รวมถึงการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN และกล่อง forkhead O1 (FoxO1) พร้อมไซต์ที่มีผลผูกพัน miR-2121.22.38.
FoxO1 เป็นหนึ่งในปัจจัยการถอดรหัส (FoxO) มีส่วนร่วมในการพัฒนามะเร็งของมนุษย์ประเภทต่างๆ และสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนต้านเนื้องอก เช่น p21, p27, Bim และ FasL40FoxO1 สามารถจับและกระตุ้นสารยับยั้งวัฏจักรของเซลล์ เช่น p27 เพื่อยับยั้งการเติบโตของเซลล์นอกจากนี้ FoxO1 ยังเป็นเอฟเฟกต์หลักของการส่งสัญญาณ PI3K/Akt และควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่าง เช่น การก้าวหน้าของวัฏจักรของเซลล์ และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ผ่านการเปิดใช้งานการถอดรหัส p2742
โดยสรุป เราเชื่อว่า exosomal miR-21 ที่ได้มาจาก microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma อาจมีบทบาทสำคัญในฐานะตัวควบคุมการเจริญเติบโตของเซลล์ glioma (รูปที่ 7)อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อค้นหาความเชื่อมโยงโดยตรงระหว่าง exosomal miR-21 การติดเชื้อ Toxoplasma ที่เปลี่ยนแปลง และการเจริญเติบโตของ gliomaผลลัพธ์เหล่านี้คาดว่าจะเป็นจุดเริ่มต้นในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างการติดเชื้อ Toxoplasma และอุบัติการณ์ของเนื้องอกไกลโอมา
แผนภาพแสดงกลไกของการเกิดมะเร็งไกลโอมา (สมอง) ถูกนำเสนอในการศึกษานี้ผู้เขียนวาดใน PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA)
ระเบียบวิธีการทดลองทั้งหมดในการศึกษานี้ รวมถึงการใช้สัตว์ เป็นไปตามแนวทางจริยธรรมมาตรฐานของคณะกรรมการการดูแลสัตว์และผู้ใช้มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล และได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการพิจารณาประจำสถาบันของคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล (หมายเลข IRB SNU- 150715)-2)ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้ดำเนินการตามคำแนะนำ ARRIVE
microglia ของเมาส์ BV2 และเซลล์ glioma ของมนุษย์ U87 ได้รับการเพาะเลี้ยงใน Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) ของ Dulbecco และ Medium ของ Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene) ตามลำดับ โดยแต่ละเซลล์มีซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10%, 4 mM l- กลูตามีน, เพนิซิลลิน 0.2 มิลลิโมลาร์ และสเตรปโตมัยซิน 0.05 มิลลิโมลาร์เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตู้ฟักที่มี 5% CO2 ที่ 37°Cเซลล์ไกลโอมาอีกสายหนึ่งคือ U118 ถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ U87
ในการแยกเอ็กโซโซมจากสายพันธุ์ RH และ ME49 ที่ติดเชื้อ T. gondii นั้น T. gondii tachyzoites (สายพันธุ์ RH) ถูกเก็บเกี่ยวจากช่องท้องของหนู BALB/c อายุ 6 สัปดาห์ที่ฉีดเมื่อ 3-4 วันก่อนTachyzoites ถูกล้างด้วย PBS สามครั้งและทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นแยกใน 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)เพื่อให้ได้ทาไคซอยต์ของสายพันธุ์ ME49 หนู BALB/c ถูกฉีดในช่องท้องด้วยซีสต์เนื้อเยื่อ 20 ซีสต์ และเก็บการเปลี่ยนแปลงของทาไคซอยต์ในซีสต์โดยการล้างช่องท้องในวันที่ 6-8 หลังการติดเชื้อ (PI)หนูติดเชื้อ PBSME49 tachyzoites ปลูกในเซลล์ที่เสริมด้วยเพนิซิลลิน 100 μg / ml (Gibco / BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL) และซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 5% (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) ที่อุณหภูมิ 37 °C และคาร์บอนไดออกไซด์ 5%หลังจากการเพาะเลี้ยงในเซลล์ Vero ทาไคซอยต์ ME49 ถูกส่งสองครั้งผ่านเข็มขนาด 25 เกจ จากนั้นผ่านตัวกรองขนาด 5 µm เพื่อกำจัดเศษและเซลล์ออกหลังจากการล้าง ทาไคซอยต์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS44ซีสต์เนื้อเยื่อของ Toxoplasma gondii สายพันธุ์ ME49 ได้รับการดูแลโดยการฉีดซีสต์ในช่องท้องที่แยกได้จากสมองของหนู C57BL / 6 ที่ติดเชื้อ (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea)สมองของหนูที่ติดเชื้อ ME49 ได้รับการเก็บเกี่ยวหลังจาก PI เป็นเวลา 3 เดือนและสับด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อแยกซีสต์หนูที่ติดเชื้อจะถูกเก็บไว้ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อโรคพิเศษ (SPF) ที่คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล
Total RNA ถูกสกัดจาก exosomes ที่ได้มาจาก BV2, เซลล์ BV2 และเนื้อเยื่อโดยใช้ miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต รวมถึงเวลาฟักตัวสำหรับขั้นตอนการชะล้างความเข้มข้นของ RNA ถูกกำหนดบนเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000ประเมินคุณภาพของไมโครอาร์เรย์ RNA โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, เนเธอร์แลนด์)
DMEM ที่มี FBS ที่ไม่ดีเป็นพิเศษ 10% ถูกเตรียมโดยการปั่นแยกด้วยความเข้มข้นสูงพิเศษที่ 100,000 กรัม เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 4°C และกรองผ่านตัวกรอง 0.22 ไมโครเมตร (นาลจีน, โรเชสเตอร์, NY, สหรัฐอเมริกา)เพาะเลี้ยงเซลล์ BV2 ขนาด 5 × 105 ใน DMEM ซึ่งมี FBS ที่ทำให้หมดสภาพจากภายนอก 10% และยาปฏิชีวนะ 1% ที่ 37°C และ 5% CO2หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ทาไคซอยต์ของสายพันธุ์ RH หรือ ME49 (MOI = 10) ถูกเติมไปยังเซลล์และปรสิตที่ไม่รุกรานจะถูกกำจัดออกภายในหนึ่งชั่วโมงและเติม DMEM ใหม่เอ็กโซโซมจากเซลล์ BV2 ถูกแยกออกโดยการปั่นแยกแบบดิฟเฟอเรนเชียลแบบดัดแปลง ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดแขวนลอยเพลเลตเอ็กโซโซมใหม่ใน PBS 300 ไมโครลิตรสำหรับการวิเคราะห์ RNA หรือโปรตีนความเข้มข้นของ exosome ที่แยกได้ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) และเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000
การตกตะกอนจากเซลล์ BV2 หรือเอ็กโซโซมที่ได้จาก BV2 ถูกสลายในสารละลายสกัดโปรตีน PRO-PREP™ (เทคโนโลยีชีวภาพ iNtRon, ซองนัม, เกาหลี) และโปรตีนถูกโหลดลงบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ SDS 10% สีฟ้าสดใสของ Coomassieนอกจากนี้ โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF เป็นเวลา 2 ชั่วโมงWestern blots ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ Alix antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) เป็นเครื่องหมายภายนอกHRP-conjugated แพะต่อต้านเมาส์ IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) และ LAS-1000 พร้อมเครื่องวิเคราะห์ภาพเรืองแสง (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) ถูกนำมาใช้เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ-ทำกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านเพื่อศึกษาขนาดและสัณฐานวิทยาของเอ็กโซโซมเอ็กโซโซมที่แยกได้จากเซลล์ BV2 (6.40 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร) ถูกเตรียมบนตาข่ายที่เคลือบด้วยคาร์บอนและย้อมเชิงลบด้วยยูรานิล อะซิเตต 2% เป็นเวลา 1 นาทีตัวอย่างที่เตรียมไว้ถูกสังเกตที่แรงดันไฟฟ้าเร่ง 80 kV โดยใช้ JEOL 1200-EX II (โตเกียว ญี่ปุ่น) ที่ติดตั้งกล้อง CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA)
exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ถูกย้อมโดยใช้ชุด PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องเซลล์ U87, 2×105, ที่มีเอ็กโซโซมที่มีป้ายกำกับ PKH26 (สีแดง) หรือไม่มีเอ็กโซโซมเป็นตัวควบคุมเชิงลบ, ถูกบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในเครื่องฟัก CO2 5%นิวเคลียสของเซลล์ U87 ถูกย้อมด้วย DAPI (สีน้ำเงิน) เซลล์ U87 ได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C จากนั้นวิเคราะห์ในระบบกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Germany)สังเกตได้
cDNA ถูกสังเคราะห์จาก siRNA โดยใช้การสังเคราะห์สายแรกของ Mir-X siRNA และชุด SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) โดยใช้ไพรเมอร์และเทมเพลตผสมกับ SYBR PremixDNA ถูกขยายสำหรับ 40 รอบของการสูญเสียสภาพที่ 95°C เป็นเวลา 15 วินาทีและการอบอ่อนที่ 60°C เป็นเวลา 60 วินาทีข้อมูลจากปฏิกิริยา PCR แต่ละรายการได้รับการวิเคราะห์โดยใช้โมดูลการวิเคราะห์ข้อมูลของซอฟต์แวร์ระบบออพติคอล iQ™5 (Bio-Rad)การเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในการแสดงออกของยีนระหว่างยีนเป้าหมายที่เลือกและ β-actin/siRNA (และ U6) ถูกคำนวณโดยใช้วิธีเส้นโค้งมาตรฐานลำดับไพรเมอร์ที่ใช้แสดงไว้ในตารางที่ 1
เซลล์ไกลโอมา U87 จำนวน 3 x 104 ถูกเพาะในเพลต 96 หลุมและผสมกับเอ็กโซโซมที่ติดเชื้อทอกโซพลาสมาที่ได้มาจาก BV2 (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือเอ็กโซโซมแบบไม่พัลส์ที่ได้มาจาก BV2 (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นตัวควบคุมที่ 12, 18 และ 36 ชั่วโมง .อัตราการเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้ Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (ตัวเลขเสริม S1-S3)
หนูเปลือย BALB/c ตัวเมียอายุ 5 สัปดาห์ถูกซื้อจาก Orient Bio (ซองนัม-ซี, เกาหลีใต้) และแยกเก็บในกรงปลอดเชื้อที่อุณหภูมิห้อง (22 ± 2 ° C) และความชื้น (45 ± 15 ° C)%) ที่อุณหภูมิห้อง (22±2°C) และความชื้น (45±15%)วงจรแสง 12 ชั่วโมงและวงจรความมืด 12 ชั่วโมงดำเนินการภายใต้ SPF (ศูนย์สัตว์แพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล)หนูถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม กลุ่มละ 5 ตัว และทุกกลุ่มถูกฉีดใต้ผิวหนังด้วย PBS 400 มล. ที่มีเซลล์ glioma U87 1 x 107 และปัจจัยการเจริญเติบโตลด BD Matrigel ™ (BD Science, Miami, FL, USA)หกวันหลังการฉีดเนื้องอก เอ็กโซโซม 200 มก. ที่ได้มาจากเซลล์ BV2 (ที่มี/ไม่มีการติดเชื้อทอกโซพลาสมา) จะถูกฉีดเข้าไปในบริเวณเนื้องอกยี่สิบสองวันหลังการติดเชื้อเนื้องอก ขนาดเนื้องอกของหนูในแต่ละกลุ่มถูกวัดด้วยคาลิเปอร์สามครั้งต่อสัปดาห์ และปริมาตรของเนื้องอกคำนวณโดยสูตร: 0.5×(กว้าง)×2×ยาว
การวิเคราะห์การแสดงออกของ MicroRNA โดยใช้อาร์เรย์ miRCURYTM LNA miRNA รุ่นที่ 7 มีอาร์เรย์ mmu และ rno (EXIQON, Vedbaek, เดนมาร์ก) ครอบคลุมหนูที่มีลักษณะเฉพาะ 1,119 ตัวจากโพรบจับ miRNA ของมนุษย์ เมาส์ และหนู 3100 ตัวในระหว่างขั้นตอนนี้ RNA ทั้งหมด 250 ถึง 1,000 ng จะถูกลบออกจาก 5′-ฟอสเฟตโดยการรักษาด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสในลำไส้ลูกวัวตามด้วยการติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงสีเขียว Hy3จากนั้นตัวอย่างที่มีป้ายกำกับจะถูกไฮบริดโดยการโหลดสไลด์ microarray โดยใช้ชุดห้องไฮบริไดเซชัน (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) และชุดสไลด์ไฮบริไดเซชัน (Agilent Technologies)ไฮบริไดเซชันถูกดำเนินการเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 56°C จากนั้นไมโครอาร์เรย์ถูกล้างตามคำแนะนำของผู้ผลิตจากนั้น สไลด์ไมโครอาร์เรย์ที่ผ่านการประมวลผลจะถูกสแกนโดยใช้ระบบเครื่องสแกนไมโครอาร์เรย์ Agilent G2565CA (Agilent Technologies)ภาพที่สแกนถูกนำเข้าโดยใช้ซอฟต์แวร์ Agilent Feature Extraction เวอร์ชัน 10.7.3.1 (Agilent Technologies) และความเข้มของแสงเรืองแสงของแต่ละภาพถูกหาปริมาณโดยใช้ไฟล์ GAL ที่สอดคล้องกันของโปรโตคอล Exiqon ที่ถูกแก้ไขข้อมูลไมโครเรย์สำหรับการศึกษาปัจจุบันถูกเก็บไว้ในฐานข้อมูล GEO ภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติ GPL32397
วิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกของ miRNAs exosomal ที่โตเต็มที่ใน microglia ของสายพันธุ์ RH หรือ ME49 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องมือเครือข่ายต่างๆmiRNAs ที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของเนื้องอกถูกระบุโดยใช้ miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) และกรองออกด้วยความเข้มของสัญญาณปกติ (log2) มากกว่า 8.0ในบรรดา miRNA นั้น miRNA ที่แสดงออกแตกต่างกันนั้นพบว่ามีการเปลี่ยนแปลงมากกว่า 1.5 เท่าโดยการวิเคราะห์ตัวกรองของ miRNA ที่เปลี่ยนแปลงโดยสายพันธุ์ RH หรือ ME49 ที่ติดเชื้อ T. gondii
เซลล์ถูกเพาะในเพลตหกหลุม (3 x 105 เซลล์/หลุม) ใน opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) โดยใช้ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)เซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 6 ชั่วโมง และจากนั้นตัวกลางถูกเปลี่ยนเป็นตัวกลางที่สดใหม่เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์ชัน
การวิเคราะห์ทางสถิติส่วนใหญ่ดำเนินการโดยใช้การทดสอบของนักเรียนด้วยซอฟต์แวร์ Excel (Microsoft, Washington, DC, USA)สำหรับการวิเคราะห์สัตว์ทดลอง การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Prism 3.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ ค่า P < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการพิจารณาประจำสถาบันของคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล (หมายเลข IRB SNU-150715-2)
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
เฟอร์ลีย์ เจ. และคณะประมาณการอุบัติการณ์และการเสียชีวิตของโรคมะเร็งทั่วโลกในปี 2561: แหล่งที่มาและวิธีการของ GLOBOCANการตีความ.เจ. รัก 144, 1941–1953 (2019)
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษา Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาRashid, S. , Rehman, K. และ Akash, MS การทบทวนปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาที่สำคัญ Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ผู้ช่วยศาสตราจารย์ Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงทางการรักษาRashid, S. , Rehman, K. และ Akash, MS การทบทวนปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาที่สำคัญวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์เภสัชกร.143, 112119 (2021)
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งอวัยวะเพศหญิง: บทสรุปของหลักฐานทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการ Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งอวัยวะเพศหญิง: บทสรุปของหลักฐานทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการKato I. , Zhang J. และ Sun J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งของระบบทางเดินอาหารของมนุษย์และระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: สรุปข้อมูลทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการ Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和实验室证据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียกับไวรัสในการย่อยอาหารในช่องปากของมนุษย์และระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: สรุปวิทยาศาสตร์โรคยอดนิยมและหลักฐานทางห้องปฏิบัติการKato I. , Zhang J. และ Sun J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งระบบทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งอวัยวะเพศหญิง: สรุปข้อมูลทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการมะเร็ง 14, 425 (2022)
Magon, KL และ Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนและไขมันในเซลล์โฮสต์อย่างไร Magon, KL และ Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนและไขมันในเซลล์โฮสต์อย่างไรMahon, KL และ Parish, JL การติดเชื้อจากมะเร็ง: ไวรัสเนื้องอกจาก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนส่วนกลางและการเผาผลาญไขมันของเซลล์เจ้าบ้านได้อย่างไร Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中จิตวิญญาณ碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนส่วนกลางและการเผาผลาญไขมันของเซลล์เจ้าบ้านได้อย่างไรMahon, KL และ Parish, JL ทำให้เกิดการติดเชื้อมะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนและไขมันในเซลล์เจ้าบ้านได้อย่างไรเปิดชีววิทยา11/210004 (2021)
Correia da Costa, JM และคณะCatechol estrogens ของ schistosomes และ flukes ตับ และมะเร็งที่เกี่ยวข้องกับหนอนพยาธิด้านหน้า.ข้างในร้อน5, 444 (2014)