ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
Toxoplasma gondii เป็นปรสิตโปรโตซัวภายในเซลล์ที่ปรับเปลี่ยนสภาพแวดล้อมจุลภาคของโฮสต์ที่ติดเชื้อและเป็นที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับอุบัติการณ์ของการเติบโตของเนื้องอกในสมองในการศึกษานี้ เราตั้งสมมติฐานว่า exosomal miRNA-21 จากการติดเชื้อ Toxoplasma ส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอกในสมองExosomes จาก BV2 microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma มีลักษณะเฉพาะและการทำให้เป็นภายในของเซลล์ U87 glioma ได้รับการยืนยันโปรไฟล์การแสดงออกของ exosomal microRNA ถูกวิเคราะห์โดยใช้อาร์เรย์ของ microRNA และ microRNA-21A-5p ที่เกี่ยวข้องกับ Toxoplasma gondii และการคัดแยกเนื้องอกนอกจากนี้เรายังตรวจสอบระดับ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกในเซลล์ U87 glioma โดยการเปลี่ยนแปลงระดับ miR-21 ใน exosomes และผลของ exosomes ต่อการเพิ่มจำนวนเซลล์ U87 glioma ของมนุษย์ใน exosomes ของเซลล์ U87 glioma ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii การแสดงออกของ microRNA-21 จะเพิ่มขึ้น และกิจกรรมของยีนต่อต้านเนื้องอก (FoxO1, PTEN และ PDCD4) จะลดลงexosomes ที่ได้จาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนของเซลล์ U87 gliomaExosomes กระตุ้นการเติบโตของเซลล์ U87 ในแบบจำลองเนื้องอกของหนูเราแนะนำว่า exosomal miR-21 ที่เพิ่มขึ้นใน BV2 microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma อาจมีบทบาทสำคัญในการเป็นตัวกระตุ้นการเติบโตของเซลล์ในเซลล์ U87 glioma โดยการลดการควบคุมยีนต้านมะเร็ง
มีการประเมินว่ามีผู้ป่วยมะเร็งระยะลุกลามมากกว่า 18.1 ล้านรายทั่วโลกในปี 2561 โดยมีการวินิจฉัยเนื้องอกของระบบประสาทส่วนกลางประมาณ 297,000 รายในแต่ละปี (1.6% ของเนื้องอกทั้งหมด)1การวิจัยก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าปัจจัยเสี่ยงในการพัฒนาเนื้องอกในสมองของมนุษย์ ได้แก่ ผลิตภัณฑ์เคมีต่างๆ ประวัติครอบครัว และรังสีไอออไนซ์จากอุปกรณ์รักษาและวินิจฉัยศีรษะอย่างไรก็ตาม ยังไม่ทราบสาเหตุที่แน่ชัดของมะเร็งเหล่านี้ประมาณ 20% ของมะเร็งทั้งหมดทั่วโลกมีสาเหตุมาจากเชื้อ เช่น ไวรัส แบคทีเรีย และปรสิต3,4เชื้อโรคที่ติดเชื้อทำลายกลไกทางพันธุกรรมของเซลล์โฮสต์ เช่น การซ่อมแซม DNA และวัฏจักรของเซลล์ และอาจนำไปสู่การอักเสบเรื้อรังและทำลายระบบภูมิคุ้มกัน5
สารติดเชื้อที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งในมนุษย์คือเชื้อโรคไวรัสที่พบได้บ่อยที่สุด รวมทั้งไวรัสตับอักเสบบีและซีของมนุษย์ และไวรัสตับอักเสบบีและซีปรสิตยังสามารถมีบทบาทสำคัญในการพัฒนามะเร็งของมนุษย์ปรสิตหลายชนิด ได้แก่ Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis และ Hymenolepis nana มีส่วนเกี่ยวข้องกับมะเร็งของมนุษย์หลายชนิด 6,7,8
Toxoplasma gondii เป็นโปรโตซัวภายในเซลล์ที่ควบคุมสภาพแวดล้อมจุลภาคของเซลล์โฮสต์ที่ติดเชื้อปรสิตชนิดนี้ติดเชื้อประมาณ 30% ของประชากรโลก ทำให้ประชากรทั้งหมดตกอยู่ในความเสี่ยง9,10Toxoplasma gondii สามารถติดเชื้อในอวัยวะสำคัญ รวมทั้งระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) และทำให้เกิดโรคร้ายแรง เช่น เยื่อหุ้มสมองอักเสบและสมองอักเสบร้ายแรง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง9อย่างไรก็ตาม Toxoplasma gondii ยังสามารถเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมของโฮสต์ที่ติดเชื้อได้ด้วยการปรับการเติบโตของเซลล์และการตอบสนองของภูมิคุ้มกันในบุคคลที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง ซึ่งนำไปสู่การรักษาการติดเชื้อเรื้อรังที่ไม่แสดงอาการ9,11ที่น่าสนใจ เมื่อพิจารณาจากความสัมพันธ์ระหว่างความชุกของ T. gondii และอุบัติการณ์ของเนื้องอกในสมอง รายงานบางฉบับเสนอว่า ในร่างกาย การเปลี่ยนแปลงสภาพแวดล้อมของโฮสต์เนื่องจากการติดเชื้อ T. gondii เรื้อรัง คล้ายกับสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก
เอ็กโซโซมเป็นที่รู้จักกันว่าเป็นตัวสื่อสารระหว่างเซลล์ที่ส่งเนื้อหาทางชีววิทยา รวมถึงโปรตีนและกรดนิวคลีอิกจากเซลล์ข้างเคียง16,17เอ็กโซโซมสามารถมีอิทธิพลต่อกระบวนการทางชีววิทยาที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เช่น การต้านการตายของเซลล์ การกำเนิดหลอดเลือด และการแพร่กระจายในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกโดยเฉพาะอย่างยิ่ง miRNAs (miRNAs) ซึ่งเป็น RNA ขนาดเล็กที่ไม่เข้ารหัสซึ่งมีความยาวประมาณ 22 นิวคลีโอไทด์ เป็นตัวควบคุมยีนหลังการถอดรหัสที่สำคัญซึ่งควบคุมมากกว่า 30% ของ mRNA ของมนุษย์ผ่านทางสารเชิงซ้อนที่เหนี่ยวนำด้วย miRNA (miRISC)Toxoplasma gondii สามารถรบกวนกระบวนการทางชีวภาพโดยการควบคุมการแสดงออกของ miRNA ในโฮสต์ที่ติดเชื้อMiRNAs ของโฮสต์มีสัญญาณที่สำคัญสำหรับการควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาของโฮสต์เพื่อให้บรรลุกลยุทธ์การอยู่รอดของปรสิตดังนั้น การศึกษาการเปลี่ยนแปลงในโปรไฟล์ miRNA ของโฮสต์เมื่อติดเชื้อ T. gondii สามารถช่วยให้เราเข้าใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และ T. gondii ได้ชัดเจนยิ่งขึ้นแท้จริง Thirugnanam et al.15 แนะนำว่า T. gondii ส่งเสริมการก่อมะเร็งในสมองโดยการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของมันบน miRNAs โฮสต์เฉพาะที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตของเนื้องอก และพบว่า T. gondii สามารถทำให้เกิด gliomas ในสัตว์ทดลอง
การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนแปลงของ exosomal miR-21 ในโฮสต์ microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma BV2เราสังเกตเห็นบทบาทที่เป็นไปได้ของ miR-21 exosomal ที่เปลี่ยนแปลงในการเติบโตของเซลล์ U87 glioma เนื่องจากการกักเก็บไว้ในนิวเคลียสของ FoxO1/p27 ซึ่งเป็นเป้าหมายของ miR-21 ที่แสดงออกมากเกินไป
Exosomes ที่ได้จาก BV2 ได้รับมาโดยใช้การหมุนเหวี่ยงแบบแยกส่วนและตรวจสอบโดยวิธีการต่างๆ เพื่อป้องกันการปนเปื้อนกับส่วนประกอบของเซลล์หรือตุ่มอื่นๆSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) แสดงรูปแบบที่แตกต่างกันระหว่างโปรตีนที่สกัดจากเซลล์ BV2 และ exosomes (รูปที่ 1A) และตัวอย่างได้รับการประเมินสำหรับการมีอยู่ของ Alix ซึ่งวิเคราะห์โดย Western blotting ของเครื่องหมายโปรตีน exosomal ในพบการติดฉลาก Alix ในโปรตีน exosome แต่ไม่พบในโปรตีน lysate ของเซลล์ BV2 (รูปที่ 1B)นอกจากนี้ RNA บริสุทธิ์จาก exosomes ที่ได้จาก BV2 ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพหน่วยย่อยของไรโบโซม 18S และ 28S ไม่ค่อยพบในรูปแบบการย้ายถิ่นของ RNA exosomal ซึ่งบ่งชี้ถึงความบริสุทธิ์ที่เชื่อถือได้ (รูปที่ 1C)ในที่สุด กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเอ็กโซโซมที่สังเกตได้นั้นมีขนาดประมาณ 60–150 นาโนเมตรและมีโครงสร้างคล้ายถ้วยตามแบบฉบับของสัณฐานวิทยาของเอกโซโซม (รูปที่ 1D)
ลักษณะของ exosomes ที่ได้จากเซลล์ BV2(A) หน้าเอกสารข้อมูลความปลอดภัยแยกโปรตีนออกจากเซลล์ BV2 หรือเอกโซโซมที่ได้จาก BV2รูปแบบโปรตีนแตกต่างกันระหว่างเซลล์และเซลล์ภายนอก(B) การวิเคราะห์ Western blot ของ exosomal marker (Alix)(C) การประเมิน RNA บริสุทธิ์จากเซลล์ BV2 และ exosomes ที่ได้จาก BV2 โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพดังนั้น จึงไม่ค่อยพบหน่วยย่อยของไรโบโซม 18S และ 28S ในเซลล์ BV2 ใน exosomal RNA(D) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านแสดงให้เห็นว่าเอกโซโซมที่แยกได้จากเซลล์ BV2 นั้นถูกย้อมด้วยยูเรนิลอะซิเตต 2% ในเชิงลบExosomes มีขนาดประมาณ 60-150 นาโนเมตรและมีรูปร่างคล้ายถ้วย (Song and Jung, ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่)
การทำให้เซลล์ภายในเซลล์ของ exosomes ที่ได้จาก BV2 เข้าไปในเซลล์ Glioma ของมนุษย์ U87 ถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลexosomes ที่ติดฉลาก PKH26 นั้นแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไซโตพลาสซึมของเซลล์ U87นิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI (รูปที่ 2A) ซึ่งบ่งชี้ว่า exosomes ที่ได้จาก BV2 สามารถถูกทำให้เป็นภายในโดยเซลล์โฮสต์และมีอิทธิพลต่อสภาพแวดล้อมของเซลล์ผู้รับ
การทำให้เอ็กโซโซมที่ได้จาก BV2 เข้าสู่เซลล์ U87 glioma และ exosomes ที่ได้จาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนของเซลล์ U87 glioma(A) Exosomes ล้อมรอบโดยเซลล์ U87 ที่วัดด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเซลล์ไกลโอมา U87 ถูกบ่มด้วยเอ็กโซโซมที่ติดฉลากด้วย PKH26 (สีแดง) หรือไม่มีการควบคุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมงนิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI (สีน้ำเงิน) จากนั้นสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (แถบมาตราส่วน: 10 μm, x 3000)(B) การเพิ่มจำนวนเซลล์ U87 glioma ถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์เซลล์ U87 glioma ได้รับการรักษาด้วย exosomes ตามเวลาที่กำหนด * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P < 0.05 โดยการทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้จากการทดสอบของนักเรียน
หลังจากยืนยันการทำให้ exosomes ที่ได้จาก BV2 เข้าสู่เซลล์ Glioma ของ U87 เราได้ทำการทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์เพื่อตรวจสอบบทบาทของ exosomes ที่ได้จาก Toxoplasma ที่ได้จาก BV2 ในการพัฒนาเซลล์ glioma ของมนุษย์การรักษาเซลล์ U87 ด้วย exosomes จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii แสดงให้เห็นว่า exosomes ที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii ทำให้การแพร่กระจายของเซลล์ U87 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2B)
นอกจากนี้ การเจริญเติบโตของเซลล์ U118 มีผลเช่นเดียวกับ U87 เนื่องจาก Toxoplasma กระตุ้น exosomes ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในระดับสูงสุด (ไม่แสดงข้อมูล)จากข้อมูลเหล่านี้ เราสามารถระบุได้ว่า exosomes ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ที่ได้รับ BV2 มีบทบาทสำคัญในการเพิ่มจำนวนเซลล์ glioma
ในการตรวจสอบผลกระทบของ exosomes ที่ได้จาก BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ต่อการพัฒนาของเนื้องอก เราฉีดเซลล์ U87 glioma เข้าไปในหนูเปลือยสำหรับแบบจำลอง xenograft และฉีด exosomes ที่ได้จาก BV2 หรือ exosomes ที่ได้จาก BV2 ที่ติดเชื้อ RHหลังจากตรวจพบเนื้องอกหลังจาก 1 สัปดาห์ กลุ่มทดลองแต่ละกลุ่มที่มีหนู 5 ตัวถูกแบ่งตามขนาดเนื้องอกเพื่อกำหนดจุดเริ่มต้นเดียวกัน และวัดขนาดเนื้องอกเป็นเวลา 22 วัน
ในหนูที่มีแบบจำลอง xenograft U87 ขนาดและน้ำหนักของเนื้องอกที่ใหญ่กว่าอย่างมีนัยสำคัญถูกสังเกตพบในกลุ่ม exosome ที่ติดเชื้อ RH ที่ได้รับ BV2 ในวันที่ 22 (รูปที่ 3A, B)ในทางกลับกัน ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในขนาดเนื้องอกระหว่างกลุ่มเอ็กโซโซมที่ได้รับ BV2 และกลุ่มควบคุมหลังการรักษาด้วยเอ็กโซโซมนอกจากนี้ หนูที่ฉีดด้วยเซลล์ glioma และ exosomes ยังแสดงปริมาณเนื้องอกที่ใหญ่ที่สุดในกลุ่มของ exosomes ที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ RH (รูปที่ 3C)ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า exosomes ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ที่ได้รับ BV2 กระตุ้นการเจริญเติบโตของ glioma ในรูปแบบเนื้องอกของหนู
Oncogenesis (AC) ของ exosomes ที่ได้จาก BV2 ในแบบจำลองเมาส์ xenograft U87ขนาดเนื้องอก (A) และน้ำหนัก (B) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูเปลือย BALB/c ที่รักษาด้วย exosomes ที่ติดเชื้อ RH ซึ่งได้มาจาก BV2หนูเปลือย BALB/c (C) ถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังด้วยเซลล์ U87 1 x 107 เซลล์ที่แขวนลอยอยู่ในส่วนผสมของ Matrigelหกวันหลังการฉีด exosomes ที่ได้จาก BV2 100 ไมโครกรัมได้รับการรักษาในหนูวัดขนาดและน้ำหนักของเนื้องอกในวันที่ระบุและหลังการเสียสละตามลำดับ * P < 0.05. * P < 0.05. * รัส < 0,05. * P < 0.05. *P <0.05。 *P <0.05。 * รัส < 0,05. * P < 0.05.
ข้อมูลแสดงให้เห็นว่า 37 miRNAs (16 แสดงออกมากเกินไปและ 21 แสดงออกลดลง) ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันหรือการพัฒนาของเนื้องอกมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน microglia หลังจากติดเชื้อ Toxoplasma RH สายพันธุ์ (รูปที่ 4A)ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miR-21 ท่ามกลาง miRNAs ที่เปลี่ยนแปลงได้รับการยืนยันโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ใน exosomes ที่ได้มาจาก BV2, exosomes ที่รักษาด้วยเซลล์ BV2 และ U87การแสดงออกของ miR-21 แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน exosomes จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ RH) (รูปที่ 4B)ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miR-21 ในเซลล์ BV2 และ U87 เพิ่มขึ้นหลังจากได้รับ exosomes ที่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 4B)ระดับสัมพัทธ์ของการแสดงออกของ miR-21 ในเนื้อเยื่อสมองของผู้ป่วยเนื้องอกและหนูที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ ME49) นั้นสูงกว่ากลุ่มควบคุมตามลำดับ (รูปที่ 4C)ผลลัพธ์เหล่านี้มีความสัมพันธ์กับความแตกต่างระหว่างระดับการแสดงออกของ microRNAs ที่คาดการณ์และยืนยัน ในหลอดทดลอง และในร่างกาย
การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ exosomal miP-21a-5p ใน microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (RH)(A) แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใน siRNA ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันหรือการพัฒนาของเนื้องอกหลังจากการติดเชื้อ T. gondii RH(B) ระดับการแสดงออกของ miR-21 สัมพัทธ์ถูกตรวจพบโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ในเซลล์ exosomes ที่ได้จาก BV2, exosomes ที่ได้รับ BV2 และเซลล์ U87(C) พบระดับการแสดงออกของ miR-21 สัมพัทธ์ในเนื้อเยื่อสมองของผู้ป่วยเนื้องอก (N=3) และหนูที่ติดเชื้อ Toxoplasma gondii (สายพันธุ์ ME49) (N=3) * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้รับโดยใช้การทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้จากการทดสอบของนักเรียน
Exosomes จากเซลล์ BV2 ที่ติดเชื้อ RH ทำให้เกิดการเจริญเติบโตของ gliomas ในร่างกายและในหลอดทดลอง (รูปที่ 2, 3)ในการตรวจหา mRNAs ที่เกี่ยวข้อง เราตรวจสอบระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายต้านมะเร็ง, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN และโปรแกรมเซลล์ตาย 4 (PDCD4) ในเซลล์ U87 ที่ติดเชื้อ exosomes ที่ได้มาจาก BV2 หรือ RH BV2การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศแสดงให้เห็นว่ายีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกหลายตัว รวมถึงยีน FoxO1, PTEN และ PDCD4 มีตำแหน่งการจับกับ miR-2121,22ระดับ mRNA ของยีนเป้าหมายต้านเนื้องอกลดลงในเอ็กโซโซมที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ RH เมื่อเปรียบเทียบกับเอ็กโซโซมที่ได้รับ BV2 (รูปที่ 5A)FoxO1 แสดงระดับโปรตีนที่ลดลงในเอ็กโซโซมที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ RH เมื่อเปรียบเทียบกับเอ็กโซโซมที่ได้รับ BV2 (รูปที่ 5B)จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราสามารถยืนยันได้ว่า exosomes ที่ได้จาก RH-infected BV2 ลดการควบคุมยีนต้านมะเร็ง โดยคงบทบาทในการเจริญเติบโตของเนื้องอก
Exosomes ที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH ทำให้เกิดการยับยั้งยีนต้านเนื้องอกในเซลล์ U87 glioma โดย exosomes ที่ได้รับ BV2 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma RH(A) PCR แบบเรียลไทม์ของการแสดงออกของ FoxO1, PTEN และ PDCD4 ใน exosomes ที่ได้มาจาก BV2 ที่ติดเชื้อ T. gondii RH เมื่อเปรียบเทียบกับ exosomes ของ PBSβ-actin mRNA ถูกใช้เป็นตัวควบคุม(B) การแสดงออกของ FoxO1 ถูกกำหนดโดย Western blotting และข้อมูลการวัดความหนาแน่นได้รับการประเมินทางสถิติโดยใช้โปรแกรม ImageJ * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน * P <0.05 ได้มาจากการทดสอบของนักเรียน *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้รับโดยใช้การทดสอบของนักเรียน *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0.05 ได้จากการทดสอบของนักเรียน
เพื่อทำความเข้าใจผลของ miP-21 ใน exosomes ต่อการควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก เซลล์ U87 ได้รับการถ่ายเซลล์ด้วยสารยับยั้ง miP-21 โดยใช้ Lipofectamine 2000 และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังการถ่ายเซลล์ระดับการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 ในเซลล์ที่ถ่ายด้วยสารยับยั้ง miR-21 ถูกเปรียบเทียบกับเซลล์ที่รักษาด้วย exosomes ที่ได้จาก BV2 โดยใช้ qRT-PCR (รูปที่ 6A, B)ทรานส์เฟกชันของตัวยับยั้ง miR-21 เข้าไปในเซลล์ U87 ลดการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6)
miP-21 exosomal BV2 ที่ติดเชื้อ RH เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ FoxO1 / p27 ในเซลล์ U87 gliomaเซลล์ U87 ถูกถ่ายด้วยสารยับยั้ง miP-21 โดยใช้ Lipofectamine 2000 และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังจากการถ่ายเซลล์ระดับการแสดงออกของ FoxO1 และ p27 ในเซลล์ที่ถ่ายด้วยสารยับยั้ง miR-21 ถูกเปรียบเทียบกับระดับในเซลล์ที่รักษาด้วย exosomes ที่ได้จาก BV2 โดยใช้ qRT-PCR (A, B)
เพื่อหลีกหนีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ ปรสิต Toxoplasma จะแปลงร่างเป็นถุงน้ำในเนื้อเยื่อพวกมันปรสิตในเนื้อเยื่อต่างๆ รวมทั้งสมอง หัวใจ และกล้ามเนื้อโครงร่าง ตลอดอายุขัยของโฮสต์และปรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์นอกจากนี้ยังสามารถควบคุมวัฏจักรของเซลล์และการตายของเซลล์โฮสต์ ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของพวกมัน14,24Toxoplasma gondii ส่วนใหญ่ติดเชื้อในเซลล์เดนไดรต์ของโฮสต์ นิวโทรฟิล และเชื้อสายโมโนไซต์/มาโครฟาจ รวมถึงไมโครเกลียในสมองToxoplasma gondii ทำให้เกิดความแตกต่างของ macrophages ของ M2 ฟีโนไทป์ ส่งผลต่อการสมานแผลหลังจากการติดเชื้อของเชื้อโรค และยังเกี่ยวข้องกับการเกิด hypervascularization และ granulomatous fibrosisการเกิดโรคทางพฤติกรรมของการติดเชื้อ Toxoplasma อาจเกี่ยวข้องกับเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของเนื้องอกสภาพแวดล้อมที่ไม่เป็นมิตรซึ่งควบคุมโดย Toxoplasma อาจมีลักษณะคล้ายกับ precancer ที่สอดคล้องกันดังนั้นจึงสามารถสันนิษฐานได้ว่าการติดเชื้อ Toxoplasma น่าจะมีส่วนทำให้เกิดเนื้องอกในสมองในความเป็นจริงมีรายงานอัตราการติดเชื้อ Toxoplasma ที่สูงในซีรั่มของผู้ป่วยที่มีเนื้องอกในสมองหลายชนิดนอกจากนี้ Toxoplasma gondii อาจเป็นตัวการก่อมะเร็งอีกชนิดหนึ่งและทำหน้าที่เสริมฤทธิ์กันเพื่อช่วยให้สารก่อมะเร็งที่ติดเชื้ออื่นๆ พัฒนาเนื้องอกในสมองในเรื่องนี้ เป็นที่น่าสังเกตว่าไวรัส P. falciparum และ Epstein-Barr ทำงานร่วมกันในการก่อตัวของมะเร็งต่อมน้ำเหลือง Burkitt
บทบาทของ exosomes ในฐานะหน่วยงานกำกับดูแลในด้านการวิจัยโรคมะเร็งได้รับการตรวจสอบอย่างกว้างขวางอย่างไรก็ตาม บทบาทของเอ็กโซโซมระหว่างปรสิตและโฮสต์ที่ติดเชื้อยังไม่เป็นที่เข้าใจจนถึงตอนนี้ หน่วยงานกำกับดูแลต่างๆ รวมถึงโปรตีนที่หลั่งออกมา ได้อธิบายกระบวนการทางชีววิทยาที่ปรสิตโปรโตซัวต่อต้านการโจมตีของโฮสต์และแพร่เชื้ออย่างต่อเนื่องเมื่อเร็ว ๆ นี้มีแนวคิดที่เพิ่มขึ้นว่าไมโครเวสิเคิลที่เกี่ยวข้องกับโปรโตซัวและไมโครอาร์เอ็นเอของพวกมันมีปฏิสัมพันธ์กับเซลล์โฮสต์เพื่อสร้างสภาพแวดล้อมที่เอื้ออำนวยต่อการอยู่รอดดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อค้นหาความสัมพันธ์ระหว่าง miRNAs exosomal ที่เปลี่ยนแปลงและการเพิ่มจำนวนเซลล์ gliomaการเปลี่ยนแปลง MicroRNA (กลุ่มยีน miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 และ miR-17-92) เชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์ STAT3 ในมาโครฟาจของมนุษย์ที่ติดเชื้อ toxoplasma ได้รับการควบคุมและกระตุ้นการต่อต้าน -apoptosis ตอบสนองต่อการติดเชื้อ Toxoplasma gondii 29 .การติดเชื้อ Toxoplasma จะเพิ่มการแสดงออกของ miR-17-5p และ miR-106b-5p ซึ่งเกี่ยวข้องกับโรคที่มีการแบ่งตัวเกินจำนวนมาก30ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโฮสต์ miRNAs ที่ควบคุมโดยการติดเชื้อ Toxoplasma เป็นโมเลกุลที่สำคัญสำหรับการอยู่รอดของปรสิตและการเกิดโรคในพฤติกรรมทางชีววิทยาของโฮสต์
miRNAs ที่เปลี่ยนแปลงสามารถมีอิทธิพลต่อพฤติกรรมประเภทต่างๆ ในระหว่างการเริ่มต้นและการลุกลามของเซลล์มะเร็ง รวมถึง gliomas: สัญญาณการเติบโตที่พอเพียงในตัวเอง ความไม่ไวต่อสัญญาณการยับยั้งการเจริญเติบโต การหลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ ศักยภาพในการจำลองแบบไม่จำกัด การสร้างเส้นเลือดใหม่ การบุกรุกและการแพร่กระจาย และการอักเสบใน glioma มีการระบุ miRNAs ที่เปลี่ยนแปลงในการศึกษาการทำโปรไฟล์การแสดงออกหลายครั้ง
ในการศึกษาปัจจุบัน เรายืนยันการแสดงออกของ miRNA-21 ในระดับสูงในเซลล์โฮสต์ที่ติดเชื้อทอกโซพลาสมาmiR-21 ได้รับการระบุว่าเป็นหนึ่งใน microRNAs ที่แสดงออกบ่อยที่สุดในเนื้องอกที่เป็นของแข็ง รวมถึง gliomas, 33 และการแสดงออกของมันสัมพันธ์กับระดับของ gliomaหลักฐานที่สะสมบ่งชี้ว่า miR-21 เป็น oncogene ใหม่ที่ทำหน้าที่เป็นปัจจัยต่อต้านการตายของเซลล์มะเร็งในการเจริญเติบโตของ glioma และมีการแสดงออกมากเกินไปในเนื้อเยื่อและพลาสมาของมะเร็งในสมองของมนุษย์สิ่งที่น่าสนใจคือการยับยั้ง miR-21 ในเซลล์และเนื้อเยื่อของ glioma ทำให้เกิดการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์เนื่องจากการตายของเซลล์ที่ขึ้นกับ caspaseการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของเป้าหมายที่ทำนายด้วย miR-21 เผยให้เห็นยีนต้านมะเร็งหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการตายของเซลล์ รวมถึงโปรแกรมการตายของเซลล์ 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN และ forkhead box O1 (FoxO1) ด้วยตำแหน่งการจับ miR-2121.22.38.
FoxO1 ซึ่งเป็นหนึ่งในปัจจัยการถอดความ (FoxO) มีส่วนเกี่ยวข้องในการพัฒนามะเร็งของมนุษย์ประเภทต่างๆ และสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนต้านมะเร็ง เช่น p21, p27, Bim และ FasL40FoxO1 สามารถจับและเปิดใช้งานสารยับยั้งวัฏจักรของเซลล์ เช่น p27 เพื่อยับยั้งการเติบโตของเซลล์นอกจากนี้ FoxO1 ยังเป็นเอฟเฟกต์หลักของการส่งสัญญาณ PI3K/Akt และควบคุมกระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่าง เช่น ความก้าวหน้าของวัฏจักรของเซลล์และการแยกเซลล์ผ่านการเปิดใช้งานการถอดรหัส p2742
โดยสรุป เราเชื่อว่า exosomal miR-21 ที่ได้จาก microglia ที่ติดเชื้อ Toxoplasma อาจมีบทบาทสำคัญในฐานะตัวควบคุมการเติบโตของเซลล์ glioma (รูปที่ 7)อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อค้นหาความเชื่อมโยงโดยตรงระหว่าง exosomal miR-21, การติดเชื้อ Toxoplasma ที่เปลี่ยนแปลง และการเจริญเติบโตของ gliomaผลลัพธ์เหล่านี้คาดว่าจะเป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างการติดเชื้อ Toxoplasma และอุบัติการณ์ของ glioma
แผนภาพแสดงกลไกของการเกิดมะเร็งสมอง (สมอง) ถูกนำเสนอในการศึกษานี้ผู้เขียนวาดใน PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA)
โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดในการศึกษานี้ รวมถึงการใช้สัตว์ เป็นไปตามแนวทางจริยธรรมมาตรฐานของคณะกรรมการการดูแลสัตว์และผู้ใช้ของมหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาสถาบันของคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล (หมายเลข IRB SNU- 150715).-2).ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำของ ARRIVE
microglia ของหนู BV2 และเซลล์ glioma ของมนุษย์ U87 ได้รับการเพาะเลี้ยงใน Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) ของ Dulbecco และ Medium ของ Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene) ตามลำดับ โดยแต่ละชนิดประกอบด้วย 10% fetal bovine serum, 4 mM l- กลูตามีน เพนิซิลลิน 0.2 มิลลิโมลาร์ และสเตรปโตมัยซิน 0.05 มิลลิโมลาร์เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตู้อบที่มี 5% CO2 ที่ 37°ซเซลล์ Glioma อีกสายหนึ่งคือ U118 ถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ U87
เพื่อแยกเอกโซโซมออกจากสายพันธุ์ RH และ ME49 ที่ติดเชื้อ T. gondii, T. gondii tachyzoites (สายพันธุ์ RH) ถูกเก็บเกี่ยวจากช่องท้องของหนู BALB/c อายุ 6 สัปดาห์ที่ฉีด 3-4 วันก่อนหน้าTachyzoites ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS และทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นแยกใน 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43เพื่อให้ได้ทาคีโซไซต์ของสายพันธุ์ ME49 หนูเมาส์ BALB/c ถูกฉีดเข้าทางช่องท้องด้วยซีสต์ของเนื้อเยื่อ 20 ชิ้น และการเก็บการเปลี่ยนแปลงของแทคีซอยต์ในซีสต์โดยการล้างช่องท้องในวันที่ 6-8 หลังการติดเชื้อ (PI)หนูที่ติดเชื้อ PBSME49 tachyzoites ปลูกในเซลล์ที่เสริมด้วยเพนิซิลลิน 100 ไมโครกรัม/มล. (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 ไมโครกรัม/มล. สเตรปโตมัยซิน (Gibco/BRL) และ 5% fetal bovine serum (Lonza, Walkersville, MD) .., สหรัฐอเมริกา) ที่ 37 °C และ 5% คาร์บอนไดออกไซด์หลังจากการเพาะเลี้ยงในเซลล์ Vero แล้ว ME49 tachyzoites ถูกส่งผ่านสองครั้งผ่านเข็มขนาด 25 เกจ และจากนั้นผ่านตัวกรอง 5 µm เพื่อกำจัดเศษซากและเซลล์หลังจากการล้าง ทาคีซอยต์ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS44ซีสต์ของเนื้อเยื่อของ Toxoplasma gondii สายพันธุ์ ME49 ได้รับการดูแลโดยการฉีดซีสต์เข้าทางช่องท้องของซีสต์ที่แยกได้จากสมองของหนูที่ติดเชื้อ C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea)สมองของหนูที่ติดเชื้อ ME49 ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 3 เดือนของ PI และถูกบดขยี้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อแยกซีสต์หนูที่ติดเชื้อถูกเก็บไว้ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อโรคพิเศษ (SPF) ที่โรงเรียนแพทย์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล
Total RNA ถูกสกัดจากเอกโซโซมที่ได้จาก BV2, เซลล์ BV2 และเนื้อเยื่อโดยใช้ miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต รวมถึงเวลาฟักตัวสำหรับขั้นตอนการชะออกความเข้มข้นของ RNA ถูกกำหนดด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000คุณภาพของ RNA microarrays ได้รับการประเมินโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพ Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, เนเธอร์แลนด์)
DMEM ที่มี 10% exosome-poor FBS ถูกเตรียมโดยการหมุนเหวี่ยงแบบอุลตร้าที่ 100,000 กรัมเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 4°C และกรองผ่านตัวกรอง 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA)เซลล์ BV2 ขนาด 5 × 105 ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่มี FBS 10% exosome-depleted และ 1% ยาปฏิชีวนะที่ 37°C และ 5% CO2หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง ทาคีโซต์ของสายพันธุ์ RH หรือ ME49 (MOI = 10) ถูกเติมเข้าไปในเซลล์ และปรสิตที่ไม่รุกรานถูกกำจัดออกภายในหนึ่งชั่วโมงและเติมด้วย DMEMExosomes จากเซลล์ BV2 ถูกแยกออกโดยการปั่นแยกส่วนต่างแบบดัดแปลง ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายแขวนเม็ด exosome ใหม่ใน 300 µl PBS สำหรับการวิเคราะห์ RNA หรือโปรตีนความเข้มข้นของเอกโซโซมที่แยกได้ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด อิลลินอยส์ สหรัฐอเมริกา) และเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000
ตะกอนจากเซลล์ BV2 หรือเอกโซโซมที่ได้จาก BV2 ถูกทำให้แตกตัวในสารละลายสกัดโปรตีน PRO-PREP™ (เทคโนโลยีชีวภาพ iNtRon, ซองนัม, เกาหลี) และบรรจุโปรตีนลงบนเจลโพลีอะคริลาไมด์ SDS 10% ของ Coomassie ที่ย้อมด้วยสีน้ำเงินนอกจากนี้ โปรตีนยังถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF เป็นเวลา 2 ชั่วโมงWestern blots ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ Alix antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) เป็นเครื่องหมาย exosomalHRP-conjugated แพะต่อต้านหนู IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) และเครื่องวิเคราะห์ภาพเรืองแสง LAS-1000 บวก (Fuji Photographic Film, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ.ใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านเพื่อศึกษาขนาดและสัณฐานวิทยาของเอ็กโซโซมเอ็กโซโซมที่แยกได้จากเซลล์ BV2 (6.40 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร) ถูกเตรียมบนตะแกรงเคลือบคาร์บอนและย้อมด้วยยูเรนิลอะซีเตต 2% เป็นเวลา 1 นาทีตัวอย่างที่เตรียมไว้ถูกตรวจสอบที่แรงดันไฟฟ้า 80 kV โดยใช้ JEOL 1200-EX II (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) พร้อมกับกล้อง CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, USA)
exosomes ที่ได้จาก BV2 ถูกย้อมโดยใช้ PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องเซลล์ U87, 2×105, ที่มีเอ็กโซโซมที่ติดฉลาก PKH26 (สีแดง) หรือไม่มีเอ็กโซโซมเป็นตัวควบคุมเชิงลบ ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในตู้บ่ม CO2 5%นิวเคลียสของเซลล์ U87 ถูกย้อมด้วย DAPI (สีน้ำเงิน) เซลล์ U87 ได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C จากนั้นวิเคราะห์ในระบบกล้องจุลทรรศน์ Confocal Microscope ของ Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Germany)สังเกตได้
cDNA ถูกสังเคราะห์จาก siRNA โดยใช้ Mir-X siRNA first strand synthesis และ SYBR qRT-PCR kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ระบบตรวจจับ PCR แบบเรียลไทม์ iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) โดยใช้ไพรเมอร์และเทมเพลตผสมกับ SYBR PremixDNA ถูกขยายสำหรับ 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95°C เป็นเวลา 15 วินาที และการหลอมที่ 60°C เป็นเวลา 60 วินาทีข้อมูลจากแต่ละปฏิกิริยา PCR ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้โมดูลการวิเคราะห์ข้อมูลของซอฟต์แวร์ระบบออปติก iQ™5 (Bio-Rad)การเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ในการแสดงออกของยีนระหว่างยีนเป้าหมายที่เลือกและ β-actin/siRNA (และ U6) ถูกคำนวณโดยใช้วิธีเส้นโค้งมาตรฐานลำดับไพรเมอร์ที่ใช้แสดงในตารางที่ 1
เซลล์ glioma U87 จำนวน 3 x 104 เซลล์ถูกเพาะในเพลต 96 หลุมและผสมกับ exosomes ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ซึ่งได้มาจาก BV2 (50 μg/mL) หรือ exosomes แบบไม่มีชีพจรที่ได้มาจาก BV2 (50 μg/mL) เป็นตัวควบคุมที่ 12, 18 และ 36 ชั่วโมง .อัตราการเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้ Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (ตัวเลขเสริม S1-S3) 46
หนูเปลือย BALB/c เพศเมียอายุ 5 สัปดาห์ถูกซื้อจาก Orient Bio (Seongnam-si, เกาหลีใต้) และเก็บไว้ในกรงปลอดเชื้อที่อุณหภูมิห้อง (22 ± 2 ° C) และความชื้น (45 ± 15 ° C)%) ที่อุณหภูมิห้อง (22±2°C) และความชื้น (45±15%)รอบแสง 12 ชั่วโมงและรอบมืด 12 ชั่วโมงดำเนินการภายใต้ SPF (ศูนย์สัตว์คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแห่งชาติโซล)หนูถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม กลุ่มละ 5 ตัว และทุกกลุ่มถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังด้วย PBS 400 มล. ที่มีเซลล์ glioma U87 1 x 107 เซลล์ และปัจจัยการเจริญเติบโตลด BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA)หกวันหลังการฉีดเนื้องอก exosomes 200 มก. ที่ได้จากเซลล์ BV2 (ที่มี/ไม่มีการติดเชื้อ Toxoplasma) ถูกฉีดเข้าไปในบริเวณเนื้องอกยี่สิบสองวันหลังจากการติดเชื้อเนื้องอก ขนาดเนื้องอกของหนูในแต่ละกลุ่มถูกวัดด้วยคาลิปเปอร์สามครั้งต่อสัปดาห์ และคำนวณปริมาตรเนื้องอกโดยใช้สูตร: 0.5×(กว้าง)×2×ความยาว
การวิเคราะห์การแสดงออกของ MicroRNA โดยใช้อาร์เรย์ miRNA ของ miRCURYTM LNA รุ่นที่ 7 มีอาร์เรย์ mmu และ rno (EXIQON, Vedbaek, เดนมาร์ก) ครอบคลุมหนูที่มีลักษณะเฉพาะ 1119 ตัวจากโพรบจับ miRNA ของมนุษย์ หนูเมาส์ และหนู 3100 ตัวในระหว่างขั้นตอนนี้ RNA ทั้งหมด 250 ถึง 1,000 ng ถูกกำจัดออกจาก 5′-ฟอสเฟตโดยการบำบัดด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสในลำไส้ลูกวัวตามด้วยการติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงสีเขียว Hy3จากนั้นตัวอย่างที่มีป้ายกำกับจะถูกผสมโดยการโหลดสไลด์ microarray โดยใช้ชุดกล้องไฮบริไดเซชัน (Agilent Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) และชุดสไลด์ไฮบริไดเซชัน (Agilent Technologies)การผสมพันธุ์ถูกดำเนินการเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 56°ซ จากนั้นจึงล้างไมโครอะเรย์ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสไลด์ microarray ที่ผ่านการประมวลผลจะถูกสแกนโดยใช้ระบบสแกนเนอร์ microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies)รูปภาพที่สแกนถูกนำเข้าโดยใช้ซอฟต์แวร์ Agilent Feature Extraction เวอร์ชัน 10.7.3.1 (Agilent Technologies) และวัดความเข้มของแสงเรืองแสงของแต่ละรูปภาพโดยใช้ไฟล์ GAL ที่สอดคล้องกันของโปรโตคอล Exiqon ที่แก้ไขแล้วข้อมูล Microarray สำหรับการศึกษาปัจจุบันถูกฝากไว้ในฐานข้อมูล GEO ภายใต้หมายเลขภาคยานุวัติ GPL32397
โปรไฟล์การแสดงออกของ miRNAs exosomal ที่โตเต็มที่ใน microglia ของสายพันธุ์ RH หรือ ME49 ที่ติดเชื้อ Toxoplasma ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องมือเครือข่ายต่างๆmiRNAs ที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาของเนื้องอกถูกระบุโดยใช้ miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) และกรองออกด้วยความเข้มของสัญญาณปกติ (log2) ที่มากกว่า 8.0ในบรรดา miRNAs พบว่า miRNAs ที่แสดงออกแตกต่างกันนั้นมีการเปลี่ยนแปลงมากกว่า 1.5 เท่าโดยการวิเคราะห์ตัวกรองของ miRNAs ที่เปลี่ยนแปลงโดยสายพันธุ์ RH หรือ ME49 ที่ติดเชื้อ T. gondii
เซลล์ถูกเพาะในจานหกหลุม (3 x 105 เซลล์/หลุม) ใน opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) โดยใช้ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)เพาะเลี้ยงเซลล์ที่ถ่ายทรานส์เฟกเป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นจึงเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นอาหารสดสมบูรณ์เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังจากการถ่ายเซลล์
การวิเคราะห์ทางสถิติส่วนใหญ่ดำเนินการโดยใช้การทดสอบของนักเรียนด้วยซอฟต์แวร์ Excel (Microsoft, Washington, DC, USA)สำหรับการวิเคราะห์สัตว์ทดลอง การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Prism 3.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. ค่า P <0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดย Institutional Review Board of the Seoul National University School of Medicine (IRB number SNU-150715-2)
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
เฟอร์ลีย์ เจ และคณะอุบัติการณ์และการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งทั่วโลกโดยประมาณในปี 2561: แหล่งที่มาและวิธีการของ GLOBOCANการตีความ.เจ. รัค 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษา Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาRashid, S., Rehman, K. และ Akash, MS การทบทวนปัจจัยเสี่ยงสำหรับเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาที่สำคัญ Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS เข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับปัจจัยเสี่ยงของเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาRashid, S., Rehman, K. และ Akash, MS การทบทวนปัจจัยเสี่ยงสำหรับเนื้องอกในสมองและการแทรกแซงการรักษาที่สำคัญวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์.เภสัชกร.143, 112119 (2564).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: บทสรุปของหลักฐานทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการ Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: บทสรุปของหลักฐานทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการKato I., Zhang J. และ Sun J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งของระบบทางเดินอาหารของมนุษย์และระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: บทสรุปของข้อมูลทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการ Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和实验室证据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในการย่อยอาหารในช่องปากของมนุษย์และระบบสืบพันธุ์เพศหญิง: บทสรุปของวิทยาศาสตร์โรคที่เป็นที่นิยมและหลักฐานทางห้องปฏิบัติการKato I. , Zhang J. และ Sun J. ปฏิกิริยาระหว่างแบคทีเรียและไวรัสในมะเร็งทางเดินอาหารของมนุษย์และมะเร็งอวัยวะสืบพันธุ์สตรี: บทสรุปของข้อมูลทางระบาดวิทยาและห้องปฏิบัติการมะเร็ง 14, 425 (2022)
Magon, KL & Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงคาร์บอนกลางของเซลล์โฮสต์และการเผาผลาญไขมันอย่างไร Magon, KL & Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงคาร์บอนกลางของเซลล์โฮสต์และการเผาผลาญไขมันอย่างไรMahon, KL และ Parish, JL การติดเชื้อจากไฟสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอกที่ใช้ DNA เปลี่ยนแปลงคาร์บอนกลางของเซลล์โฮสต์และเมแทบอลิซึมของไขมันอย่างไร Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL จากการติดเชื้อสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงคาร์บอนกลางของเซลล์โฮสต์และเมตาบอลิซึมของไขมันอย่างไรMahon, KL และ Parish, JL เชื้อไฟไปสู่มะเร็ง: ไวรัสเนื้องอก DNA เปลี่ยนแปลงการเผาผลาญคาร์บอนและไขมันในเซลล์โฮสต์อย่างไรเปิดชีววิทยา11, 210004 (2564).
Correia da Costa, JM และคณะแคทีคอลเอสโตรเจนของสคิสโตโซมและพยาธิใบไม้ในตับและมะเร็งที่เกี่ยวข้องกับพยาธิด้านหน้า.ร้อนข้างใน5, 444 (2557).