ขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.comเวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS ที่จำกัดเพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer)ในระหว่างนี้ เพื่อให้แน่ใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ยีนพาหะสำหรับการรักษาโรคซิสติกไฟโบรซิสในปอดต้องมุ่งเป้าหมายไปที่ทางเดินหายใจที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้า เนื่องจากการส่งต่อของปอดส่วนปลายไม่มีผลในการรักษาประสิทธิภาพของการถ่ายโอนไวรัสเกี่ยวข้องโดยตรงกับเวลาที่อยู่อาศัยของพาหะอย่างไรก็ตาม ของเหลวที่นำส่ง เช่น สารพาหะของยีนจะกระจายเข้าสู่ถุงลมตามธรรมชาติระหว่างการหายใจเข้า และอนุภาคในการรักษาไม่ว่ารูปร่างใดๆ ก็ตามจะถูกกำจัดออกอย่างรวดเร็วโดยการขนส่งของเยื่อเมือกการขยายเวลาที่อยู่อาศัยของพาหะของยีนในทางเดินหายใจเป็นสิ่งสำคัญแต่ทำได้ยากอนุภาคแม่เหล็กที่เชื่อมด้วยพาหะที่สามารถนำไปยังพื้นผิวของทางเดินหายใจสามารถปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายในระดับภูมิภาคได้เนื่องจากปัญหาเกี่ยวกับการถ่ายภาพในร่างกาย พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กดังกล่าวบนพื้นผิวทางเดินลมหายใจในที่ที่มีสนามแม่เหล็กที่ใช้อยู่นั้นไม่เป็นที่เข้าใจจุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการใช้การถ่ายภาพซินโครตรอนเพื่อให้เห็นภาพการเคลื่อนที่ของชุดอนุภาคแม่เหล็กในหลอดลมของหนูทดลองที่ดมยาสลบ เพื่อศึกษาไดนามิกและรูปแบบพฤติกรรมของอนุภาคเดี่ยวและอนุภาคจำนวนมากในร่างกายจากนั้นเรายังประเมินว่าการนำส่งอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสต่อหน้าสนามแม่เหล็กจะเพิ่มประสิทธิภาพของการส่งผ่านในหลอดลมของหนูหรือไม่การถ่ายภาพเอ็กซ์เรย์ซินโครตรอนแสดงพฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กในสนามแม่เหล็กที่อยู่นิ่งและเคลื่อนที่ในหลอดทดลองและในร่างกายอนุภาคไม่สามารถลากผ่านพื้นผิวของทางเดินหายใจที่มีชีวิตได้อย่างง่ายดายโดยใช้แม่เหล็ก แต่ในระหว่างการขนส่ง คราบสะสมจะกระจุกตัวอยู่ที่มุมมอง ซึ่งเป็นสนามแม่เหล็กที่แรงที่สุดประสิทธิภาพการถ่ายทอดยังเพิ่มขึ้นหกเท่าเมื่อส่งอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสต่อหน้าสนามแม่เหล็กเมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสและสนามแม่เหล็กอาจเป็นแนวทางที่มีค่าในการปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายเวกเตอร์ของยีนและระดับการถ่ายโอนในทางเดินหายใจที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้า ในร่างกาย
โรคซิสติกไฟโบรซิส (CF) เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของยีนเดี่ยวที่เรียกว่า CF transmembrane conductance regulator (CFTR)โปรตีน CFTR เป็นช่องไอออนที่มีอยู่ในเซลล์เยื่อบุผิวจำนวนมากทั่วร่างกาย รวมถึงทางเดินหายใจ ซึ่งเป็นตำแหน่งหลักในการเกิดโรคซิสติกไฟโบรซิสข้อบกพร่องใน CFTR นำไปสู่การขนส่งน้ำที่ผิดปกติ การคายน้ำของพื้นผิวทางเดินหายใจ และความลึกของชั้นของเหลวที่พื้นผิวทางเดินหายใจ (ASL) ลดลงนอกจากนี้ยังลดความสามารถของระบบขนส่งเยื่อเมือก (MCT) ในการล้างทางเดินหายใจของอนุภาคและเชื้อโรคที่หายใจเข้าไปเป้าหมายของเราคือการพัฒนาการรักษาด้วยยีน lentiviral (LV) เพื่อส่งมอบสำเนาที่ถูกต้องของยีน CFTR และปรับปรุง ASL, MCT และสุขภาพของปอด และเพื่อพัฒนาเทคโนโลยีใหม่ที่สามารถวัดค่าพารามิเตอร์เหล่านี้ใน vivo1 ต่อไป
LV vectors เป็นหนึ่งในตัวเลือกชั้นนำสำหรับการรักษาด้วยยีนซิสติกไฟโบรซิส ส่วนใหญ่เป็นเพราะพวกมันสามารถรวมยีนที่ใช้รักษาโรคเข้ากับเซลล์ฐานทางเดินหายใจ (เซลล์ต้นกำเนิดทางเดินหายใจ) อย่างถาวรสิ่งนี้มีความสำคัญเนื่องจากสามารถคืนความชุ่มชื้นตามปกติและการล้างเมือกโดยแยกความแตกต่างออกเป็นเซลล์พื้นผิวทางเดินหายใจที่แก้ไขโดยยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคซิสติกไฟโบรซิส ซึ่งส่งผลดีตลอดชีวิตเวกเตอร์ LV จะต้องพุ่งเข้าหาทางเดินหายใจที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้า เนื่องจากเป็นจุดที่ปอดเริ่มมีส่วนร่วมใน CFการนำพาหะเข้าไปในปอดลึกขึ้นอาจส่งผลให้เกิดการเคลื่อนผ่านของถุงลม แต่สิ่งนี้ไม่มีผลในการรักษาโรคซิสติกไฟโบรซิสอย่างไรก็ตาม ของเหลว เช่น พาหะของยีนจะย้ายเข้าสู่ถุงลมโดยธรรมชาติเมื่อสูดดมหลังคลอดบุตร3,4 และอนุภาคทางการแพทย์จะถูกขับออกอย่างรวดเร็วไปยังช่องปากโดย MCTประสิทธิภาพของการถ่ายโอน LV เกี่ยวข้องโดยตรงกับระยะเวลาที่เวกเตอร์ยังคงอยู่ใกล้กับเซลล์เป้าหมายเพื่อให้การดูดซึมของเซลล์ – “เวลาที่อยู่อาศัย” 5 ซึ่งสั้นลงได้ง่ายโดยการไหลของอากาศในภูมิภาคทั่วไป เช่นเดียวกับการดูดซึมเมือกและอนุภาค MCT ที่ประสานกันสำหรับโรคซิสติก ไฟโบรซิส ความสามารถในการยืดระยะเวลาการคงอยู่ของ LV ในทางเดินหายใจเป็นสิ่งสำคัญในการบรรลุระดับการถ่ายโอนที่สูงในบริเวณนี้ แต่จนถึงตอนนี้ก็ยังเป็นสิ่งที่ท้าทาย
เพื่อเอาชนะอุปสรรคนี้ เราเสนอว่าอนุภาคแม่เหล็ก LV (MPs) สามารถช่วยเสริมกันได้สองวิธีประการแรก พวกมันสามารถถูกนำทางด้วยแม่เหล็กไปยังพื้นผิวทางเดินหายใจเพื่อปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายและช่วยให้อนุภาคพาหะของยีนอยู่ในพื้นที่ที่ถูกต้องของทางเดินหายใจและ ASL) เคลื่อนเข้าสู่ชั้นเซลล์ 6. MPs ถูกใช้อย่างกว้างขวางในฐานะยานพาหนะนำส่งยาที่กำหนดเป้าหมายเมื่อพวกมันจับกับแอนติบอดี ยาเคมีบำบัด หรือโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ที่เกาะติดกับเยื่อหุ้มเซลล์หรือจับกับตัวรับที่ผิวเซลล์ตามลำดับ และสะสมที่บริเวณเนื้องอกใน การมีไฟฟ้าสถิตย์สนามแม่เหล็กสำหรับการรักษามะเร็ง 7. วิธีการ "hyperthermic" อื่น ๆ มีเป้าหมายเพื่อฆ่าเซลล์เนื้องอกโดยให้ความร้อนแก่ MPs เมื่อสัมผัสกับสนามแม่เหล็กที่สั่นหลักการของการทรานส์เฟกชันแบบแม่เหล็ก ซึ่งสนามแม่เหล็กถูกใช้เป็นสารทรานส์เฟกชันเพื่อเพิ่มการถ่ายโอน DNA เข้าสู่เซลล์ มักใช้ในหลอดทดลองโดยใช้ช่วงของเวกเตอร์ยีนที่ไม่ใช่ไวรัสและไวรัสสำหรับสายเซลล์ที่ทรานส์ดิวซ์ยาก ..ประสิทธิภาพของ LV magnetotransfection ด้วยการส่ง LV MP ในหลอดทดลอง เข้าไปในเซลล์ของเยื่อบุผิวในหลอดลมของมนุษย์ในที่ที่มีสนามแม่เหล็กสถิต เพิ่มประสิทธิภาพของการถ่ายโอน 186 เท่าเมื่อเทียบกับเวกเตอร์ LV เพียงอย่างเดียวนอกจากนี้ LV MT ยังถูกนำไปใช้กับแบบจำลองในหลอดทดลองของซิสติกไฟโบรซิส โดยที่การถ่ายด้วยแม่เหล็กจะเพิ่มการถ่ายโอน LV ในการเพาะเลี้ยงส่วนต่อประสานระหว่างอากาศและของเหลวถึง 20 เท่าเมื่อมีเสมหะซิสติกไฟโบรซิสอย่างไรก็ตาม การตรวจด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าในอวัยวะในร่างกายได้รับความสนใจค่อนข้างน้อย และได้รับการประเมินจากการศึกษาในสัตว์เพียงเล็กน้อยเท่านั้น โดยเฉพาะในปอด 16,17อย่างไรก็ตาม ความเป็นไปได้ของการถ่ายแม่เหล็กในการบำบัดปอดในโรคซิสติกไฟโบรซิสนั้นมีความชัดเจนตาลและคณะ(2020) ระบุว่า “การศึกษาตรวจสอบประสิทธิภาพการนำส่งอนุภาคนาโนแม่เหล็กในปอดอย่างมีประสิทธิภาพจะปูทางสำหรับกลยุทธ์การสูดดม CFTR ในอนาคตเพื่อปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกในผู้ป่วยโรคซิสติกไฟโบรซิส”6
พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กบนพื้นผิวของทางเดินหายใจในที่ที่มีสนามแม่เหล็กที่ใช้อยู่นั้นยากที่จะมองเห็นและศึกษา ดังนั้นจึงเข้าใจได้ไม่ดีนักในการศึกษาอื่นๆ เราได้พัฒนาวิธีการถ่ายภาพเอกซเรย์คอนทราสต์เฟสที่ใช้ซินโครตรอน (PB-PCXI) สำหรับการถ่ายภาพแบบไม่รุกรานและการหาปริมาณของการเปลี่ยนแปลงภายในร่างกายในนาทีที่ความลึก ASL18 และพฤติกรรม MCT1920 เพื่อวัดความชุ่มชื้นของผิวช่องก๊าซโดยตรง และใช้เป็นตัวชี้วัดประสิทธิภาพการรักษาในระยะเริ่มต้นนอกจากนี้ วิธีการให้คะแนน MCT ของเรายังใช้อนุภาคขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 10–35 µm ที่ประกอบด้วยอลูมินาหรือแก้วดัชนีการหักเหของแสงสูงเป็นเครื่องหมาย MCT ที่มองเห็นได้ด้วย PB-PCXI21ทั้งสองวิธีเหมาะสำหรับการถ่ายภาพอนุภาคประเภทต่างๆ รวมถึง MPs
เนื่องจากความละเอียดเชิงพื้นที่และเชิงเวลาสูง การทดสอบ ASL และ MCT ที่ใช้ PB-PCXI ของเราจึงเหมาะสมอย่างยิ่งในการศึกษาไดนามิกและรูปแบบพฤติกรรมของอนุภาคเดี่ยวและอนุภาคจำนวนมากในร่างกาย เพื่อช่วยให้เราเข้าใจและเพิ่มประสิทธิภาพวิธีการนำส่งยีน MPวิธีการที่เราใช้ที่นี่ขึ้นอยู่กับการศึกษาของเราโดยใช้บีมไลน์ SPring-8 BL20B2 ซึ่งเรามองเห็นการเคลื่อนไหวของของเหลวหลังจากส่งปริมาณของเวกเตอร์จำลองเข้าไปในทางเดินหายใจทางจมูกและปอดของหนูเพื่อช่วยอธิบายรูปแบบการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันที่สังเกตได้ ในยีนของเราการศึกษาในสัตว์ที่มีปริมาณพาหะ 3.4
จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการใช้ซินโครตรอน PB-PCXI เพื่อแสดงภาพการเคลื่อนไหวในร่างกายของชุดของ MPs ในหลอดลมของหนูที่มีชีวิตการศึกษาเกี่ยวกับการถ่ายภาพด้วย PB-PCXI เหล่านี้ได้รับการออกแบบเพื่อทดสอบซีรี่ส์ MP ความแรงของสนามแม่เหล็ก และตำแหน่งเพื่อหาผลกระทบต่อการเคลื่อนที่ของ MPเราสันนิษฐานว่าสนามแม่เหล็กภายนอกจะช่วยให้ MF ที่ส่งอยู่หรือเคลื่อนที่ไปยังพื้นที่เป้าหมายการศึกษาเหล่านี้ยังช่วยให้เราสามารถกำหนดรูปแบบแม่เหล็กที่เพิ่มปริมาณอนุภาคที่เหลืออยู่ในหลอดลมหลังจากการทับถมในการศึกษาชุดที่สอง เรามีเป้าหมายที่จะใช้การกำหนดค่าที่เหมาะสมที่สุดนี้เพื่อแสดงให้เห็นถึงรูปแบบการถ่ายโอนซึ่งเป็นผลมาจากการนำส่ง LV-MPs ภายในร่างกายไปยังทางเดินหายใจของหนู โดยสมมติฐานที่ว่าการนำส่ง LV-MPs ในบริบทของการกำหนดเป้าหมายทางเดินหายใจจะส่งผลให้ ในประสิทธิภาพการถ่ายโอน LV ที่เพิ่มขึ้น.
การศึกษาในสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามระเบียบการที่ได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัยแอดิเลด (M-2019-060 และ M-2020-022) และคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ซินโครตรอน SPring-8การทดลองดำเนินการตามคำแนะนำของ ARRIVE
ภาพเอ็กซเรย์ทั้งหมดถ่ายที่ลำแสง BL20XU ที่ซินโครตรอน SPring-8 ในญี่ปุ่นโดยใช้การตั้งค่าคล้ายกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้21,22โดยสังเขป กล่องทดลองอยู่ห่างจากวงแหวนเก็บซิงโครตรอน 245 เมตรระยะตัวอย่างถึงเครื่องตรวจจับ 0.6 ม. ใช้สำหรับการศึกษาการถ่ายภาพอนุภาคและ 0.3 ม. สำหรับการศึกษาการถ่ายภาพในสัตว์ทดลองเพื่อสร้างเอฟเฟกต์คอนทราสต์ของเฟสใช้ลำแสงสีเดียวที่มีพลังงาน 25 keVได้รับภาพโดยใช้ตัวแปลงสัญญาณเอ็กซ์เรย์ความละเอียดสูง (SPring-8 BM3) ควบคู่กับตัวตรวจจับ sCMOSทรานสดิวเซอร์แปลงรังสีเอกซ์เป็นแสงที่มองเห็นได้โดยใช้ซินทิลเลเตอร์หนา 10 µm (Gd3Al2Ga3O12) ซึ่งจากนั้นส่งไปยังเซ็นเซอร์ sCMOS โดยใช้วัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์ x10 (NA 0.3)ตัวตรวจจับ sCMOS คือ Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics ประเทศญี่ปุ่น) ที่มีขนาดอาร์เรย์ 2048 × 2048 พิกเซล และขนาดพิกเซลดิบ 6.5 × 6.5 µmการตั้งค่านี้ให้ขนาดพิกเซลไอโซโทรปิกที่ใช้งานจริงที่ 0.51 µm และขอบเขตการมองเห็นประมาณ 1.1 มม. × 1.1 มม.ระยะเวลาเปิดรับแสง 100 มิลลิวินาทีถูกเลือกเพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนของอนุภาคแม่เหล็กภายในและภายนอกทางเดินหายใจในขณะที่ลดสิ่งแปลกปลอมเคลื่อนไหวที่เกิดจากการหายใจสำหรับการศึกษาในร่างกาย ชัตเตอร์เอ็กซ์เรย์แบบเร็วถูกวางไว้ในเส้นทางรังสีเอกซ์เพื่อจำกัดปริมาณรังสีโดยการปิดกั้นลำแสงรังสีเอกซ์ระหว่างการรับแสง
สื่อ LV ไม่ได้ถูกใช้ในการศึกษาเกี่ยวกับการถ่ายภาพด้วยภาพ SPring-8 PB-PCXI เนื่องจากห้องสร้างภาพ BL20XU ไม่ได้รับการรับรองความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 2แต่เราได้เลือกช่วงของ MPs ที่มีลักษณะเฉพาะที่ดีจากผู้ขายเชิงพาณิชย์สองราย ซึ่งครอบคลุมช่วงขนาด วัสดุ ความเข้มข้นของเหล็ก และการใช้งาน อันดับแรกเพื่อให้เข้าใจว่าสนามแม่เหล็กส่งผลต่อการเคลื่อนที่ของ MPs ในหลอดเลือดฝอยแก้วอย่างไร จากนั้นจึงเลือก ทางเดินหายใจที่มีชีวิตพื้นผิว.ขนาดของ MP แตกต่างกันไปตั้งแต่ 0.25 ถึง 18 µm และทำจากวัสดุหลายชนิด (ดูตารางที่ 1) แต่ไม่ทราบองค์ประกอบของแต่ละตัวอย่าง รวมถึงขนาดของอนุภาคแม่เหล็กใน MPจากการศึกษา MCT ที่กว้างขวางของเรา 19, 20, 21, 23, 24 เราคาดว่าจะสามารถเห็น MPs ที่ต่ำถึง 5 µm บนพื้นผิวทางเดินหายใจ เช่น โดยการลบเฟรมที่ต่อเนื่องกันเพื่อให้มองเห็นการเคลื่อนไหวของ MP ได้ดีขึ้นMP เดียวที่ 0.25 µm นั้นเล็กกว่าความละเอียดของอุปกรณ์สร้างภาพ แต่คาดว่า PB-PCXI จะตรวจจับคอนทราสต์เชิงปริมาตรและการเคลื่อนที่ของของเหลวบนพื้นผิวที่สะสมไว้หลังจากสะสม
ตัวอย่างสำหรับแต่ละ MP ในตาราง1 ถูกเตรียมในหลอดแก้วขนาด 20 ไมโครลิตร (Drummond Microcaps, PA, USA) ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.63 มม.อนุภาคของกล้ามเนื้อมีอยู่ในน้ำ ในขณะที่อนุภาคของ CombiMag มีอยู่ในของเหลวที่เป็นกรรมสิทธิ์ของผู้ผลิตแต่ละหลอดบรรจุของเหลวครึ่งหนึ่ง (ประมาณ 11 µl) และวางบนที่วางตัวอย่าง (ดูรูปที่ 1)เส้นเลือดฝอยแก้วถูกวางในแนวนอนบนเวทีในห้องถ่ายภาพ ตามลำดับ และวางที่ขอบของของเหลวแม่เหล็กเปลือกนิกเกิลขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 19 มม. (ยาว 28 มม.) ทำจากแร่แรร์เอิร์ธ นีโอไดเมียม เหล็ก และโบรอน (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, ออสเตรเลีย) ที่มีกำลังยึด 1.17 T ติดอยู่กับ a ตารางการถ่ายโอนแยกต่างหากเพื่อให้เกิดการเปลี่ยนตำแหน่งของคุณจากระยะไกลระหว่างการเรนเดอร์การถ่ายภาพเอ็กซ์เรย์เริ่มต้นขึ้นเมื่อแม่เหล็กอยู่ในตำแหน่งเหนือตัวอย่างประมาณ 30 มม. และรับภาพที่ 4 เฟรมต่อวินาทีในระหว่างการถ่ายภาพ แม่เหล็กถูกนำเข้าไปใกล้กับท่อแก้วแคปปิลลารี (ที่ระยะห่างประมาณ 1 มม.) จากนั้นจึงเคลื่อนไปตามท่อเพื่อประเมินผลของความแรงของสนามและตำแหน่งของสนาม
การตั้งค่าการถ่ายภาพในหลอดทดลองที่มีตัวอย่าง MP ในเส้นเลือดฝอยแก้วในขั้นตอนของการแปลตัวอย่าง xyเส้นทางของลำแสง X-ray จะถูกทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง
เมื่อมีการสร้างความสามารถในการมองเห็นของ MPs ในหลอดทดลอง ชุดย่อยของพวกมันได้รับการทดสอบในร่างกายกับหนูเผือก Wistar ตัวเมียประเภทป่า (อายุประมาณ 12 สัปดาห์, ~ 200 กรัม)เมเดโทมิดีน 0.24 มก./กก. (Domitor®, Zenoaq, Japan), มิดาโซแลม 3.2 มก./กก. (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) และ butorphanol 4 มก./กก. (Vetorphale®, Meiji Seika)หนูถูกทำให้สลบด้วยส่วนผสมของฟาร์มา (ญี่ปุ่น) โดยการฉีดเข้าช่องท้องหลังจากการดมยาสลบ พวกเขาเตรียมพร้อมสำหรับการถ่ายภาพโดยเอาขนรอบๆ หลอดลมออก ใส่ท่อช่วยหายใจ (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT) และตรึงพวกมันไว้ในท่านอนหงายบนแผ่นสร้างภาพที่ทำขึ้นเองซึ่งมีถุงเก็บความร้อน เพื่อรักษาอุณหภูมิของร่างกาย22. จากนั้นติดแผ่นสร้างภาพเข้ากับระยะตัวอย่างในกล่องสร้างภาพในมุมเล็กน้อยเพื่อจัดแนวหลอดลมในแนวนอนบนภาพเอ็กซเรย์ดังแสดงในรูปที่ 2a
(a) การตั้งค่าการถ่ายภาพในร่างกายในชุดสร้างภาพ SPring-8 เส้นทางลำแสงเอ็กซ์เรย์ทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง( b, c ) การแปลตำแหน่งแม่เหล็ก Tracheal ดำเนินการจากระยะไกลโดยใช้กล้อง IP สองตัวที่ติดตั้งแบบตั้งฉากที่ด้านซ้ายของภาพบนหน้าจอ คุณจะเห็นห่วงลวดที่ยึดส่วนหัวและท่อนำส่งซึ่งติดตั้งอยู่ภายในท่อ ET
ระบบปั๊มหลอดฉีดยาควบคุมระยะไกล (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) โดยใช้หลอดฉีดยาแก้วขนาด 100 µl เชื่อมต่อกับท่อ PE10 (0.61 มม. OD, 0.28 มม. ID) โดยใช้เข็ม 30 Gaทำเครื่องหมายที่ท่อเพื่อให้แน่ใจว่าปลายอยู่ในตำแหน่งที่ถูกต้องในหลอดลมเมื่อใส่ท่อช่วยหายใจด้วยการใช้ปั๊มขนาดเล็ก ดึงลูกสูบของกระบอกฉีดออกและจุ่มปลายหลอดลงในตัวอย่าง MP ที่จะจัดส่งจากนั้นจึงใส่ท่อนำส่งที่บรรจุเข้าไปในท่อช่วยหายใจ โดยวางปลายไว้ที่ส่วนที่แข็งแกร่งที่สุดของสนามแม่เหล็กที่เราคาดไว้การรับภาพถูกควบคุมโดยใช้เครื่องตรวจจับลมหายใจที่เชื่อมต่อกับกล่องจับเวลาที่ใช้ Arduino และสัญญาณทั้งหมด (เช่น อุณหภูมิ การหายใจ การเปิด/ปิดชัตเตอร์ และการเก็บภาพ) ถูกบันทึกโดยใช้ Powerlab และ LabChart (เครื่องมือ AD ซิดนีย์ ออสเตรเลีย) 22 เมื่อทำการถ่ายภาพ เมื่อไม่มีกล่อง กล้อง IP สองตัว (Panasonic BB-SC382) จะถูกจัดตำแหน่งให้ห่างกันประมาณ 90° และใช้เพื่อควบคุมตำแหน่งของแม่เหล็กที่สัมพันธ์กับหลอดลมระหว่างการถ่ายภาพ (รูปที่ 2b, c)เพื่อลดสิ่งแปลกปลอมในการเคลื่อนไหว ให้ได้รับภาพหนึ่งภาพต่อหนึ่งลมหายใจในช่วงที่ราบสูงของการหายใจส่วนปลาย
แม่เหล็กติดอยู่กับขั้นที่สอง ซึ่งอาจอยู่ในระยะไกลที่ด้านนอกของตัวสร้างภาพมีการทดสอบตำแหน่งและการกำหนดค่าต่างๆ ของแม่เหล็ก รวมถึง: วางที่มุมประมาณ 30° เหนือหลอดลม (การกำหนดค่าแสดงในรูปที่ 2a และ 3a)แม่เหล็กอันหนึ่งอยู่เหนือสัตว์และอีกอันอยู่ด้านล่าง โดยมีเสาสำหรับดึงดูด (รูปที่ 3b)แม่เหล็ก 1 อันอยู่เหนือสัตว์และอีกอันด้านล่าง โดยมีขั้วสำหรับผลัก (รูปที่ 3c) และแม่เหล็กอีกอันอยู่ด้านบนและตั้งฉากกับหลอดลม (รูปที่ 3d)หลังจากตั้งค่าสัตว์และแม่เหล็กและโหลด MP ที่ทดสอบลงในปั๊มกระบอกฉีดยา ให้ส่งยาขนาด 50 µl ในอัตรา 4 µl/วินาที เมื่อได้รับภาพจากนั้นแม่เหล็กจะถูกเคลื่อนกลับไปกลับมาตามหรือข้ามหลอดลมในขณะที่รับภาพต่อไป
การกำหนดค่าแม่เหล็กสำหรับการถ่ายภาพในร่างกาย (a) แม่เหล็กหนึ่งอันเหนือหลอดลมที่มุมประมาณ 30°, (b) แม่เหล็กสองอันกำหนดค่าสำหรับการดึงดูด (c) แม่เหล็กสองอันกำหนดค่าสำหรับการขับไล่ (d) แม่เหล็กหนึ่งอันด้านบนและตั้งฉากกับ หลอดลมผู้สังเกตมองลงมาจากปากถึงปอดผ่านหลอดลมและลำแสงเอ็กซ์เรย์ผ่านด้านซ้ายของหนูและออกทางด้านขวาแม่เหล็กจะเคลื่อนที่ไปตามความยาวของทางเดินหายใจหรือไปทางซ้ายและขวาเหนือหลอดลมตามทิศทางของลำแสงเอ็กซ์เรย์
เรายังพยายามตรวจสอบการมองเห็นและพฤติกรรมของอนุภาคในทางเดินหายใจในกรณีที่ไม่มีการหายใจและอัตราการเต้นของหัวใจผสมกันดังนั้น เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการถ่ายภาพ สัตว์จึงถูกทำการุณยฆาตอย่างมนุษย์เนื่องจากการใช้ยาเพนโทบาร์บิทัลเกินขนาด (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip)สัตว์บางตัวถูกทิ้งไว้บนแท่นถ่ายภาพ และหลังจากการหยุดหายใจและการเต้นของหัวใจ กระบวนการถ่ายภาพซ้ำ โดยเพิ่มปริมาณ MP เพิ่มเติมหากไม่สามารถมองเห็น MP บนพื้นผิวทางเดินหายใจ
ภาพที่ได้ได้รับการแก้ไขสำหรับพื้นที่ราบและมืด จากนั้นนำมารวมกันเป็นภาพยนตร์ (20 เฟรมต่อวินาที ความเร็วปกติ 15–25 × ขึ้นอยู่กับอัตราการหายใจ) โดยใช้สคริปต์แบบกำหนดเองที่เขียนขึ้นใน MATLAB (R2020a, The Mathworks)
การศึกษาทั้งหมดเกี่ยวกับการนำส่งเวกเตอร์ของยีน LV ได้ดำเนินการที่ศูนย์วิจัยสัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแอดิเลด และมีวัตถุประสงค์เพื่อใช้ผลการทดลอง SPring-8 เพื่อประเมินว่าการนำส่ง LV-MP ต่อหน้าสนามแม่เหล็กสามารถเพิ่มการถ่ายโอนยีนในร่างกายได้หรือไม่ .ในการประเมินผลกระทบของ MF และสนามแม่เหล็ก สัตว์สองกลุ่มได้รับการรักษา: กลุ่มหนึ่งถูกฉีดด้วย LV MF พร้อมตำแหน่งแม่เหล็ก และอีกกลุ่มหนึ่งถูกฉีดด้วยกลุ่มควบคุมที่มี LV MF โดยไม่มีแม่เหล็ก
เวกเตอร์ยีน LV ถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 25, 26เวกเตอร์ LacZ แสดงยีนเบต้า-กาแลคโตซิเดสที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นซึ่งขับเคลื่อนโดย MPSV Constitutive Promotion (LV-LacZ) ซึ่งสร้างผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสีน้ำเงินในเซลล์ที่ถูกแปลงสัญญาณ ซึ่งมองเห็นได้ที่ด้านหน้าและส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อปอดการไทเทรตดำเนินการในการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยการนับจำนวนเซลล์ LacZ-positive ด้วยตนเองโดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์เพื่อคำนวณ titer ในหน่วย TU/mlตัวพาจะถูกรักษาด้วยการแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C ละลายก่อนใช้ และจับกับ CombiMag โดยผสม 1:1 และบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลาอย่างน้อย 30 นาทีก่อนนำส่ง
หนู Sprague Dawley ปกติ (n = 3/กลุ่ม, ~2-3 ไอพีที่ดมยาสลบที่มีส่วนผสมของเมเดโทมิดีน 0.4 มก./กก. (Domitor, Ilium, ออสเตรเลีย) และคีตามีน 60 มก./กก. (Ilium, ออสเตรเลีย) ที่อายุ 1 เดือน) ip ) การฉีดยาและการ cannulation ทางปากแบบไม่ผ่าตัดด้วย cannula 16 Ga ทางหลอดเลือดดำเพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อทางเดินหายใจได้รับการถ่ายโอน LV มันถูกปรับสภาพโดยใช้โปรโตคอลการก่อกวนเชิงกลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งพื้นผิวของทางเดินหายใจถูกถูตามแนวแกนด้วยตะกร้าลวด (N-Circle, nitinol stone extractor without tip NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, สหรัฐอเมริกา) 30 น.28.จากนั้น ประมาณ 10 นาทีหลังจากการก่อกวนในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ การให้ยา LV-MP ทางหลอดลมได้ดำเนินการ
สนามแม่เหล็กที่ใช้ในการทดลองนี้ได้รับการกำหนดค่าคล้ายกับการศึกษาเอ็กซเรย์ในร่างกาย โดยใช้แม่เหล็กชนิดเดียวกันที่ยึดเหนือหลอดลมด้วยแคลมป์ขดลวดกลั่น (รูปที่ 4)ปริมาตร 50 µl (2 x 25 µl aliquots) ของ LV-MP ถูกส่งไปยังหลอดลม (n = สัตว์ 3 ตัว) โดยใช้ปิเปตปลายเจลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กลุ่มควบคุม (n = สัตว์ 3 ตัว) ได้รับ LV-MP เท่ากันโดยไม่ต้องใช้แม่เหล็กหลังจากฉีดยาเสร็จแล้ว cannula จะถูกนำออกจากท่อช่วยหายใจและสัตว์จะถูก extubateแม่เหล็กจะอยู่กับที่เป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะถอดออกหนูถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังด้วย meloxicam (1 มล./กก.) (Ilium, ออสเตรเลีย) ตามด้วยการถอนยาสลบโดยการฉีดเข้าช่องท้องของ atipamazole hydrochloride 1 มก./กก. (Antisedan, Zoetis, ออสเตรเลีย)หนูถูกทำให้อบอุ่นและสังเกตจนกว่าจะหายจากการดมยาสลบ
อุปกรณ์นำส่ง LV-MP ในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพคุณจะเห็นว่าปลอก Luer-lock สีเทาอ่อนของหลอด ET ยื่นออกมาจากปาก และปลายปิเปตเจลที่แสดงในรูปถูกสอดผ่านหลอด ET จนถึงระดับความลึกที่ต้องการเข้าไปในหลอดลม
หนึ่งสัปดาห์หลังจากขั้นตอนการบริหาร LV-MP สัตว์ถูกสังเวยอย่างมีมนุษยธรรมโดยการสูดดม CO2 100% และการแสดงออกของ LacZ ได้รับการประเมินโดยใช้การรักษา X-gal มาตรฐานของเราวงแหวนกระดูกอ่อนหางส่วนใหญ่สามวงถูกนำออกเพื่อให้แน่ใจว่าความเสียหายทางกลหรือการกักเก็บของเหลวเนื่องจากการใส่ท่อช่วยหายใจจะไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์หลอดลมแต่ละอันถูกตัดตามยาวเพื่อให้ได้สองซีกสำหรับการวิเคราะห์ และใส่ในถ้วยที่มียางซิลิโคน (Sylgard, Dow Inc) โดยใช้เข็มมินินูเทียน (Fine Science Tools) เพื่อให้เห็นภาพพื้นผิวของลำแสงการกระจายและลักษณะเฉพาะของเซลล์ทรานสดิวเซอร์ได้รับการยืนยันโดยการถ่ายภาพด้านหน้าโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon (SMZ1500) พร้อมกล้อง DigiLite และซอฟต์แวร์ TCapture (Tucsen Photonics, จีน)ภาพที่ได้มาด้วยกำลังขยาย 20 เท่า (รวมถึงการตั้งค่าสูงสุดสำหรับความกว้างเต็มของหลอดลม) โดยความยาวทั้งหมดของหลอดลมจะแสดงทีละขั้น ทำให้ภาพแต่ละภาพทับซ้อนกันมากพอเพื่อให้ภาพสามารถ "เย็บ" ได้จากนั้นรูปภาพจากหลอดลมแต่ละอันจะรวมกันเป็นภาพเดียวโดยใช้ Composite Image Editor เวอร์ชัน 2.0.3 (Microsoft Research) โดยใช้อัลกอริทึมการเคลื่อนที่แบบระนาบ พื้นที่ของการแสดงออกของ LacZ ภายในภาพคอมโพสิตของหลอดลมจากสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า28 โดยใช้การตั้งค่า 0.35 < ฮิว < 0.58, ความอิ่มตัว > 0.15 และค่า < 0.7 พื้นที่ของการแสดงออกของ LacZ ภายในภาพคอมโพสิตของหลอดลมจากสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า28 โดยใช้การตั้งค่า 0.35 < ฮิว < 0.58, ความอิ่มตัว > 0.15 และค่า < 0.7 Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. พื้นที่ของการแสดงออกของ LacZ ในภาพผสมหลอดลมจากสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้28 โดยใช้การตั้งค่า 0.350.15 และมูลค่า<0 .7如述， 使用自动自动自动脚本 （的动物只动物的气管气管气管使用使用使用，，，，，，，，，，，如，， 自动 matlab 脚本 （（（（的只气管气管复合复合复合使用使用，，，，，，，，， .................... สะโพก Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . พื้นที่ของการแสดงออกของ LacZ บนภาพคอมโพสิตของหลอดลมของสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้การตั้งค่า 0.35 < เฉดสี < 0.58 ความอิ่มตัว > 0.15 และค่า < 0.7โดยการติดตามรูปร่างของเนื้อเยื่อใน GIMP v2.10.24 หน้ากากถูกสร้างขึ้นด้วยตนเองสำหรับแต่ละภาพประกอบเพื่อระบุพื้นที่เนื้อเยื่อและป้องกันการตรวจจับที่ผิดพลาดนอกเนื้อเยื่อหลอดลมบริเวณที่เปื้อนจากภาพประกอบทั้งหมดจากสัตว์แต่ละตัวถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อให้ได้พื้นที่ที่เปื้อนทั้งหมดสำหรับสัตว์นั้นพื้นที่ทาสีถูกหารด้วยพื้นที่ทั้งหมดของหน้ากากเพื่อให้ได้พื้นที่ปกติ
หลอดลมแต่ละอันถูกฝังในพาราฟินและแบ่งส่วนหนา 5 µmส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยสีแดงกลางอย่างรวดเร็วเป็นเวลา 5 นาที และรับภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse E400, กล้อง DS-Fi3 และซอฟต์แวร์จับภาพองค์ประกอบ NIS (เวอร์ชัน 5.20.00)
การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการใน GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.)กำหนดนัยสำคัญทางสถิติที่ p ≤ 0.05ความเป็นมาตรฐานได้รับการทดสอบโดยใช้การทดสอบ Shapiro-Wilk และประเมินความแตกต่างในการย้อมสี LacZ โดยใช้การทดสอบแบบไม่มีคู่
MPS หกตัวที่อธิบายไว้ในตารางที่ 1 ได้รับการตรวจสอบโดย PCXI และการมองเห็นได้อธิบายไว้ในตารางที่ 2 PCXI มองไม่เห็นโพลีสไตรีน MPs สองตัว (MP1 และ MP2; 18 µm และ 0.25 µm ตามลำดับ) แต่สามารถระบุตัวอย่างที่เหลือได้ (ตัวอย่างแสดงในรูปที่ 5)MP3 และ MP4 มองเห็นได้น้อย (10-15% Fe3O4; 0.25 µm และ 0.9 µm ตามลำดับ)แม้ว่า MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) จะมีอนุภาคที่เล็กที่สุดที่ผ่านการทดสอบอยู่บ้าง แต่ก็เป็นอนุภาคที่เด่นชัดที่สุดผลิตภัณฑ์ CombiMag MP6 แยกแยะได้ยากในทุกกรณี ความสามารถในการตรวจจับ MFs ของเราได้รับการปรับปรุงอย่างมากโดยการเคลื่อนแม่เหล็กไปมาในแนวขนานกับเส้นเลือดฝอยเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนออกจากเส้นเลือดฝอย อนุภาคจะถูกดึงออกมาเป็นสายยาว แต่เมื่อแม่เหล็กเข้าใกล้และความแรงของสนามแม่เหล็กเพิ่มขึ้น โซ่อนุภาคจะสั้นลงเมื่ออนุภาคเคลื่อนตัวไปยังพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย (ดูวิดีโอเสริม S1 : MP4) เพิ่มความหนาแน่นของอนุภาคที่พื้นผิวในทางกลับกัน เมื่อแม่เหล็กถูกดึงออกจากเส้นเลือดฝอย ความแรงของสนามจะลดลง และ MPs จะเรียงตัวกันใหม่เป็นสายโซ่ยาวที่ยื่นออกมาจากผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย (ดูวิดีโอเสริม S2: MP4)หลังจากที่แม่เหล็กหยุดเคลื่อนที่ อนุภาคจะเคลื่อนที่ต่อไปอีกระยะหนึ่งหลังจากถึงตำแหน่งสมดุลในขณะที่ MP เคลื่อนที่เข้าหาและออกจากพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย อนุภาคแม่เหล็กมักจะดึงเศษเล็กเศษน้อยผ่านของเหลว
การมองเห็นของ MP ภายใต้ PCXI นั้นแตกต่างกันอย่างมากระหว่างตัวอย่าง(ก) MP3, (ข) MP4, (ค) MP5 และ (ง) MP6ภาพทั้งหมดที่แสดงนี้ถ่ายด้วยแม่เหล็กซึ่งวางตำแหน่งไว้ประมาณ 10 มม. เหนือเส้นเลือดฝอยโดยตรงวงกลมขนาดใหญ่ที่เห็นได้ชัดคือฟองอากาศที่ติดอยู่ในเส้นเลือดฝอย ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงคุณสมบัติขอบขาวดำของภาพคอนทราสต์เฟสกล่องสีแดงหมายถึงการขยายที่ช่วยเพิ่มคอนทราสต์โปรดทราบว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของวงจรแม่เหล็กในตัวเลขทั้งหมดไม่ได้กำหนดขนาดและใหญ่กว่าที่แสดงไว้ประมาณ 100 เท่า
เมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปทางซ้ายและขวาตามด้านบนของเส้นเลือดฝอย มุมของสตริง MP จะเปลี่ยนไปเพื่อให้สอดคล้องกับแม่เหล็ก (ดูรูปที่ 6) ซึ่งจะทำให้เส้นสนามแม่เหล็กแตกแยกสำหรับ MP3-5 หลังจากที่คอร์ดถึงมุมเกณฑ์ อนุภาคจะลากไปตามพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอยซึ่งมักส่งผลให้ MPs จับกลุ่มเป็นกลุ่มใหญ่ขึ้นใกล้กับจุดที่สนามแม่เหล็กแรงที่สุด (ดูวิดีโอเสริม S3: MP5)สิ่งนี้ยังเห็นได้ชัดโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อถ่ายภาพใกล้กับส่วนปลายของเส้นเลือดฝอย ซึ่งทำให้ MP รวมและรวมสมาธิที่ส่วนต่อประสานของของเหลวกับอากาศอนุภาคใน MP6 ซึ่งแยกแยะได้ยากกว่าอนุภาคใน MP3-5 ไม่ลากเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปตามเส้นเลือดฝอย แต่สาย MP แยกออกจากกัน ทำให้อนุภาคอยู่ในมุมมอง (ดูวิดีโอเสริม S4: MP6)ในบางกรณี เมื่อสนามแม่เหล็กที่ใช้ลดลงโดยการเคลื่อนแม่เหล็กออกไปให้ไกลจากจุดถ่ายภาพ MPs ที่เหลืออยู่จะค่อย ๆ เคลื่อนลงมาที่พื้นผิวด้านล่างของท่อด้วยแรงโน้มถ่วง ซึ่งเหลืออยู่ในเชือก (ดูวิดีโอเสริม S5: MP3) .
มุมของสตริง MP เปลี่ยนไปเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปทางขวาเหนือเส้นเลือดฝอย(ก) MP3, (ข) MP4, (ค) MP5 และ (ง) MP6กล่องสีแดงหมายถึงการขยายที่ช่วยเพิ่มคอนทราสต์โปรดทราบว่าวิดีโอเพิ่มเติมมีวัตถุประสงค์เพื่อให้ข้อมูล เนื่องจากวิดีโอเหล่านี้เปิดเผยโครงสร้างอนุภาคที่สำคัญและข้อมูลไดนามิกที่ไม่สามารถแสดงภาพได้ในภาพนิ่งเหล่านี้
การทดสอบของเราแสดงให้เห็นว่าการเคลื่อนแม่เหล็กไปมาช้าๆ ตามแนวหลอดลมช่วยอำนวยความสะดวกในการมองเห็น MF ในบริบทของการเคลื่อนไหวที่ซับซ้อนในร่างกายไม่มีการทดสอบในร่างกายเนื่องจากมองไม่เห็นเม็ดพลาสติกโพลีสไตรีน (MP1 และ MP2) ในเส้นเลือดฝอยแต่ละ MFs ที่เหลืออีกสี่ตัวได้รับการทดสอบในร่างกายโดยให้แกนยาวของแม่เหล็กอยู่เหนือหลอดลมที่มุมประมาณ 30° กับแนวดิ่ง (ดูรูปที่ 2b และ 3a) ซึ่งส่งผลให้โซ่ MF ยาวขึ้นและมีประสิทธิภาพมากขึ้น กว่าแม่เหล็ก.การกำหนดค่าสิ้นสุดลงไม่พบ MP3, MP4 และ MP6 ในหลอดลมของสัตว์ที่มีชีวิตแต่อย่างใดเมื่อแสดงภาพทางเดินหายใจของหนูหลังจากการฆ่าสัตว์อย่างมีมนุษยธรรม อนุภาคจะยังมองไม่เห็นแม้ว่าจะเพิ่มปริมาตรเพิ่มเติมโดยใช้ปั๊มหลอดฉีดก็ตามMP5 มีปริมาณเหล็กออกไซด์สูงสุดและเป็นอนุภาคเดียวที่มองเห็นได้ ดังนั้นจึงใช้เพื่อประเมินและกำหนดลักษณะพฤติกรรมของ MP ในร่างกาย
การวางแม่เหล็กเหนือหลอดลมระหว่างการใส่ MF ทำให้ MF จำนวนมากกระจุกตัวอยู่ในขอบเขตการมองเห็น แต่ไม่ใช่ทั้งหมดการเข้าไปในหลอดลมของอนุภาคจะสังเกตได้ดีที่สุดในสัตว์ที่ถูกฆ่าตายอย่างมนุษย์รูปที่ 7 และวิดีโอเสริม S6: MP5 แสดงการจับแม่เหล็กอย่างรวดเร็วและการจัดตำแหน่งของอนุภาคบนพื้นผิวของหลอดลมหน้าท้อง ซึ่งบ่งชี้ว่า MPs สามารถกำหนดเป้าหมายไปยังบริเวณที่ต้องการของหลอดลมได้เมื่อค้นหาในระยะไกลมากขึ้นตามหลอดลมหลังจากส่ง MF แล้ว MF บางตัวถูกพบใกล้กับ carina ซึ่งบ่งชี้ว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่เพียงพอที่จะรวบรวมและเก็บ MF ทั้งหมด เนื่องจากถูกส่งผ่านบริเวณที่มีความแรงของสนามแม่เหล็กสูงสุดในระหว่างการบริหารของเหลวกระบวนการ.อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของ MP หลังคลอดสูงขึ้นรอบๆ บริเวณภาพ ซึ่งบ่งชี้ว่า MP จำนวนมากยังคงอยู่ในบริเวณทางเดินลมหายใจซึ่งความแรงของสนามแม่เหล็กสูงสุด
ภาพของ (a) ก่อนและ (b) หลังจากส่ง MP5 เข้าไปในหลอดลมของหนูที่เพิ่งถูกกำจัดด้วยแม่เหล็กซึ่งวางอยู่เหนือบริเวณที่ถ่ายภาพพื้นที่ที่ปรากฎตั้งอยู่ระหว่างวงแหวนกระดูกอ่อนสองวงมีของเหลวในทางเดินหายใจก่อนที่จะส่ง MPกล่องสีแดงหมายถึงการขยายที่ช่วยเพิ่มคอนทราสต์รูปภาพเหล่านี้นำมาจากวิดีโอที่แสดงอยู่ใน S6: วิดีโอเสริม MP5
การเคลื่อนแม่เหล็กไปตามหลอดลม ในร่างกาย ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในมุมของห่วงโซ่ MP บนพื้นผิวทางเดินลมหายใจ ซึ่งคล้ายกับที่พบในเส้นเลือดฝอย (ดูรูปที่ 8 และวิดีโอเสริม S7: MP5)อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาของเรา ไม่สามารถลาก MPs ไปตามพื้นผิวของทางเดินหายใจที่มีชีวิตได้ อย่างที่เส้นเลือดฝอยทำได้ในบางกรณี โซ่ MP จะยาวขึ้นเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปทางซ้ายและขวาที่น่าสนใจคือ เรายังพบว่าห่วงโซ่อนุภาคเปลี่ยนความลึกของชั้นผิวของของไหลเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปตามหลอดลมตามยาว และขยายออกเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ตรงไปเหนือศีรษะและโซ่อนุภาคหมุนไปยังตำแหน่งแนวตั้ง (ดู วิดีโอเสริม S7): MP5 ที่ 00:09, ล่างขวา).ลักษณะเฉพาะของรูปแบบการเคลื่อนที่เปลี่ยนไปเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปทางด้านข้างด้านบนของหลอดลม (กล่าวคือ ไปทางซ้ายหรือขวาของสัตว์ แทนที่จะไปตามความยาวของหลอดลม)อนุภาคยังคงมองเห็นได้ชัดเจนในระหว่างการเคลื่อนไหว แต่เมื่อนำแม่เหล็กออกจากหลอดลม ปลายของสายอนุภาคก็มองเห็นได้ (ดูวิดีโอเสริม S8: MP5 เริ่มที่ 0:08)สิ่งนี้สอดคล้องกับพฤติกรรมที่สังเกตได้ของสนามแม่เหล็กภายใต้การกระทำของสนามแม่เหล็กที่ใช้ในเส้นเลือดฝอยแก้ว
ภาพตัวอย่างแสดง MP5 ในหลอดลมของหนูทดลองที่มีชีวิต(a) แม่เหล็กถูกใช้เพื่อให้ได้ภาพด้านบนและด้านซ้ายของหลอดลม จากนั้น (b) หลังจากเลื่อนแม่เหล็กไปทางขวากล่องสีแดงหมายถึงการขยายที่ช่วยเพิ่มคอนทราสต์รูปภาพเหล่านี้มาจากวิดีโอที่อยู่ในวิดีโอเสริมของ S7: MP5
เมื่อปรับขั้วทั้งสองในแนวเหนือ-ใต้เหนือและใต้หลอดลม (เช่น ดึงดูด; รูปที่ 3b) คอร์ด MP จะปรากฏยาวขึ้นและอยู่บนผนังด้านข้างของหลอดลมแทนที่จะอยู่บนพื้นผิวด้านหลังของ หลอดลม (ดูภาคผนวก)วิดีโอ S9:MP5)อย่างไรก็ตาม อนุภาคที่มีความเข้มข้นสูงที่จุดเดียว (เช่น พื้นผิวด้านหลังของหลอดลม) ตรวจไม่พบหลังจากการบริหารของเหลวโดยใช้อุปกรณ์แม่เหล็กคู่ ซึ่งมักจะเกิดขึ้นกับอุปกรณ์แม่เหล็กเดี่ยวจากนั้น เมื่อแม่เหล็กชิ้นหนึ่งได้รับการกำหนดค่าให้ขับไล่ขั้วตรงข้าม (รูปที่ 3c) จำนวนของอนุภาคที่มองเห็นได้ในขอบเขตการมองเห็นจะไม่เพิ่มขึ้นหลังการส่งมอบการตั้งค่าการกำหนดค่าแม่เหล็กทั้งสองแบบเป็นสิ่งที่ท้าทายเนื่องจากความแรงของสนามแม่เหล็กสูงซึ่งดึงดูดหรือผลักแม่เหล็กตามลำดับจากนั้นจึงเปลี่ยนการตั้งค่าเป็นแม่เหล็กเดี่ยวขนานกับทางเดินหายใจ แต่ผ่านทางเดินหายใจที่มุม 90 องศา เพื่อให้เส้นแรงตัดผ่านผนังหลอดลมแบบตั้งฉาก (รูปที่ 3 มิติ) ซึ่งเป็นการวางแนวที่ตั้งใจกำหนดความเป็นไปได้ของการรวมตัวของอนุภาคบน ผนังด้านข้างเป็นที่สังเกตอย่างไรก็ตาม ในการกำหนดค่านี้ ไม่มีการเคลื่อนที่ของการสะสม MF หรือการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กที่สามารถระบุได้จากผลลัพธ์ทั้งหมดเหล่านี้ การกำหนดค่าด้วยแม่เหล็กเดี่ยวและการวางแนว 30 องศาได้รับเลือกสำหรับการศึกษาในร่างกายของพาหะของยีน (รูปที่ 3a)
เมื่อสัตว์ถูกถ่ายภาพหลายครั้งทันทีหลังจากถูกสังเวยอย่างมนุษย์ การไม่มีการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อรบกวนหมายความว่าเส้นของอนุภาคที่ละเอียดและสั้นกว่าสามารถมองเห็นได้ในสนามระหว่างกระดูกอ่อนที่ชัดเจน ซึ่ง 'แกว่งไปมา' ตามการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กมองเห็นการมีอยู่และการเคลื่อนที่ของอนุภาค MP6 ได้อย่างชัดเจน
ระดับไตเตอร์ของ LV-LacZ คือ 1.8 x 108 IU/mL และหลังจากผสม 1:1 กับ CombiMag MP (MP6) สัตว์ถูกฉีดด้วยขนาด 50 µl ของขนาดยา 9 x 107 IU/ml ของ LV vehicle (เช่น 4.5 x 106 TU/หนู).).).ในการศึกษาเหล่านี้ แทนที่จะย้ายแม่เหล็กระหว่างการคลอด เรายึดแม่เหล็กไว้ในตำแหน่งเดียวเพื่อพิจารณาว่าการถ่ายโอน LV สามารถ (a) ปรับปรุงให้ดีขึ้นเมื่อเทียบกับการนำส่งเวกเตอร์ในกรณีที่ไม่มีสนามแม่เหล็กหรือไม่ และ (b) หากทางเดินหายใจสามารถทำได้ มีสมาธิเซลล์ที่ถูกแปลงในพื้นที่เป้าหมายแม่เหล็กของทางเดินหายใจส่วนบน
การมีอยู่ของแม่เหล็กและการใช้ CombiMag ร่วมกับเวกเตอร์ LV ดูเหมือนจะไม่ส่งผลเสียต่อสุขภาพสัตว์ เช่นเดียวกับโปรโตคอลการจัดส่งเวกเตอร์ LV มาตรฐานของเราภาพด้านหน้าของบริเวณหลอดลมภายใต้การรบกวนเชิงกล (รูปที่ 1 เพิ่มเติม) แสดงให้เห็นว่ากลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย LV-MP มีระดับการถ่ายโอนที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญต่อหน้าแม่เหล็ก (รูปที่ 9a)มีการย้อมสี LacZ สีน้ำเงินเพียงเล็กน้อยในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 9b)การหาปริมาณของพื้นที่ปกติที่ย้อมสี X-Gal แสดงให้เห็นว่าการบริหาร LV-MP ต่อหน้าสนามแม่เหล็กส่งผลให้มีการปรับปรุงประมาณ 6 เท่า (รูปที่ 9c)
ตัวอย่างภาพประกอบที่แสดงการถ่ายโอนหลอดลมด้วย LV-MP (a) เมื่อมีสนามแม่เหล็กและ (b) หากไม่มีแม่เหล็ก(c) การปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในพื้นที่ปกติของการถ่ายโอน LacZ ในหลอดลมด้วยการใช้แม่เหล็ก (* p = 0.029, t-test, n = 3 ต่อกลุ่ม, ค่าเฉลี่ย±ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย)
ส่วนที่ย้อมสีแดงอย่างรวดเร็วเป็นกลาง (ตัวอย่างที่แสดงในรูปที่ 2 เพิ่มเติม) ระบุว่าเซลล์ที่ย้อมด้วย LacZ มีอยู่ในตัวอย่างเดียวกันและในตำแหน่งเดียวกันกับที่รายงานก่อนหน้านี้
ความท้าทายที่สำคัญในการบำบัดด้วยยีนทางเดินหายใจยังคงอยู่ที่ตำแหน่งที่แม่นยำของอนุภาคพาหะในพื้นที่ที่สนใจ และความสำเร็จของประสิทธิภาพการถ่ายโอนในระดับสูงในปอดเคลื่อนที่ในที่ที่มีการไหลของอากาศและการกวาดล้างเสมหะสำหรับพาหะ LV ที่มีไว้สำหรับรักษาโรคระบบทางเดินหายใจในโรคซิสติกไฟโบรซิส การเพิ่มเวลาพำนักของอนุภาคพาหะในทางเดินหายใจที่เป็นสื่อกระแสไฟฟ้านั้นเป็นเป้าหมายที่ไม่อาจบรรลุได้ดังที่ Castellani et al. ชี้ให้เห็น การใช้สนามแม่เหล็กเพื่อเพิ่มการถ่ายทอดมีข้อได้เปรียบเหนือวิธีการนำส่งยีนอื่นๆ เช่น การอิเล็กโทรโพเรชัน เนื่องจากสามารถผสมผสานความเรียบง่าย ความประหยัด การนำส่งเฉพาะที่ ประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้น และเวลาฟักตัวที่สั้นลงและอาจมีขนาดยาที่ต่ำกว่าของกระสายยา10อย่างไรก็ตาม การทับถมในร่างกายและพฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กในทางเดินหายใจภายใต้อิทธิพลของแรงแม่เหล็กภายนอกไม่เคยได้รับการอธิบาย และในความเป็นจริงแล้ว ความสามารถของวิธีนี้ในการเพิ่มระดับการแสดงออกของยีนในทางเดินหายใจที่มีชีวิตที่ไม่เสียหายนั้นไม่ได้แสดงให้เห็นในสัตว์ทดลอง
การทดลองในหลอดทดลองของเราบนซินโครตรอน PCXI แสดงให้เห็นว่าอนุภาคทั้งหมดที่เราทดสอบ ยกเว้น MP โพลีสไตรีน สามารถมองเห็นได้ในการตั้งค่าภาพที่เราใช้เมื่อมีสนามแม่เหล็ก สนามแม่เหล็กจะก่อตัวเป็นสาย ซึ่งความยาวของสนามแม่เหล็กจะสัมพันธ์กับชนิดของอนุภาคและความแรงของสนามแม่เหล็ก (เช่น ความใกล้เคียงและการเคลื่อนที่ของแม่เหล็ก)ดังที่แสดงในรูปที่ 10 สายอักขระที่เราสังเกตเห็นนั้นถูกสร้างขึ้นเมื่อแต่ละอนุภาคกลายเป็นแม่เหล็กและเหนี่ยวนำให้เกิดสนามแม่เหล็กเฉพาะที่ของมันเองเขตข้อมูลที่แยกจากกันเหล่านี้ทำให้อนุภาคอื่นๆ ที่คล้ายคลึงกันรวบรวมและเชื่อมต่อกับการเคลื่อนที่ของสตริงกลุ่มเนื่องจากแรงเฉพาะที่จากแรงดึงดูดในท้องถิ่นและแรงผลักของอนุภาคอื่นๆ
แผนภาพแสดง (a, b) สายโซ่ของอนุภาคที่ก่อตัวขึ้นภายในหลอดเลือดฝอยที่บรรจุของเหลว และ (c, d) หลอดลมที่บรรจุอากาศโปรดทราบว่าเส้นเลือดฝอยและหลอดลมไม่ได้ถูกลากไปตามขนาดแผง (a) ยังมีคำอธิบายของ MF ที่มีอนุภาค Fe3O4 จัดเรียงเป็นสายโซ่
เมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่เหนือเส้นเลือดฝอย มุมของสายอนุภาคจะถึงเกณฑ์วิกฤตสำหรับ MP3-5 ที่มี Fe3O4 ซึ่งหลังจากนั้นสายอนุภาคจะไม่อยู่ในตำแหน่งเดิมอีกต่อไป แต่เคลื่อนไปตามพื้นผิวไปยังตำแหน่งใหม่แม่เหล็ก.ผลกระทบนี้น่าจะเกิดขึ้นเนื่องจากพื้นผิวของเส้นเลือดฝอยแก้วนั้นเรียบพอที่จะทำให้เกิดการเคลื่อนไหวนี้ได้ที่น่าสนใจคือ MP6 (CombiMag) ไม่ได้ทำงานในลักษณะนี้ อาจเป็นเพราะอนุภาคมีขนาดเล็กกว่า มีการเคลือบผิวหรือประจุที่พื้นผิวต่างกัน หรือของเหลวพาหะที่เป็นกรรมสิทธิ์ส่งผลต่อความสามารถในการเคลื่อนที่คอนทราสต์ในภาพอนุภาคของ CombiMag ยังอ่อนกว่า ซึ่งบ่งชี้ว่าของเหลวและอนุภาคอาจมีความหนาแน่นเท่ากัน ดังนั้นจึงไม่สามารถเคลื่อนที่เข้าหากันได้ง่ายๆอนุภาคยังสามารถติดค้างได้หากแม่เหล็กเคลื่อนที่เร็วเกินไป ซึ่งแสดงว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่สามารถเอาชนะแรงเสียดทานระหว่างอนุภาคในของไหลได้เสมอไป แสดงว่าความแรงของสนามแม่เหล็กและระยะห่างระหว่างแม่เหล็กกับพื้นที่เป้าหมายไม่ควรมาในลักษณะ เซอร์ไพรส์.สำคัญ.ผลลัพธ์เหล่านี้ยังบ่งชี้ว่าแม้ว่าแม่เหล็กจะสามารถจับอนุภาคขนาดเล็กจำนวนมากที่ไหลผ่านพื้นที่เป้าหมายได้ แต่ไม่น่าเป็นไปได้ที่แม่เหล็กจะสามารถใช้เคลื่อนย้ายอนุภาค CombiMag ไปตามพื้นผิวของหลอดลมได้ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าการศึกษา LV MF ในร่างกาย ควรใช้สนามแม่เหล็กสถิตเพื่อกำหนดเป้าหมายทางกายภาพเฉพาะบริเวณของต้นไม้ทางเดินหายใจ
เมื่ออนุภาคถูกส่งเข้าสู่ร่างกายแล้ว อนุภาคเหล่านี้ยากที่จะระบุในบริบทของเนื้อเยื่อเคลื่อนที่ที่ซับซ้อนของร่างกาย แต่ความสามารถในการตรวจจับของอนุภาคได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นโดยการเคลื่อนแม่เหล็กในแนวนอนเหนือหลอดลมเพื่อ "กระดิก" สาย MPแม้ว่าการถ่ายภาพตามเวลาจริงจะเป็นไปได้ แต่ก็ง่ายกว่าที่จะมองเห็นการเคลื่อนไหวของอนุภาคหลังจากที่สัตว์ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมความเข้มข้นของ MP มักจะสูงสุดที่ตำแหน่งนี้เมื่อวางแม่เหล็กไว้เหนือพื้นที่ถ่ายภาพ แม้ว่าปกติแล้วจะพบอนุภาคบางส่วนอยู่ลึกลงไปใต้หลอดลมซึ่งแตกต่างจากการศึกษาในหลอดทดลอง อนุภาคไม่สามารถลากลงมาในหลอดลมได้ด้วยการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กการค้นพบนี้สอดคล้องกับวิธีการที่เสมหะที่ปกคลุมพื้นผิวของหลอดลมมักจะประมวลผลอนุภาคที่หายใจเข้าไป ดักจับพวกมันไว้ในเสมหะ และต่อมาจะล้างพวกมันผ่านกลไกการกวาดล้างเยื่อเมือก
เราตั้งสมมติฐานว่าการใช้แม่เหล็กด้านบนและด้านล่างของหลอดลมเพื่อดึงดูด (รูปที่ 3b) อาจส่งผลให้เกิดสนามแม่เหล็กที่สม่ำเสมอมากกว่าสนามแม่เหล็กที่มีความเข้มข้นสูง ณ จุดหนึ่ง ซึ่งอาจส่งผลให้มีการกระจายตัวของอนุภาคที่สม่ำเสมอมากขึ้น.อย่างไรก็ตาม การศึกษาเบื้องต้นของเราไม่พบหลักฐานที่ชัดเจนในการสนับสนุนสมมติฐานนี้ในทำนองเดียวกัน การตั้งค่าแม่เหล็กคู่หนึ่งให้เป็นแรงผลัก (รูปที่ 3c) ไม่ได้ส่งผลให้อนุภาคตกตะกอนในบริเวณภาพมากขึ้นการค้นพบทั้งสองนี้แสดงให้เห็นว่าการตั้งค่าแม่เหล็กคู่ไม่ได้ปรับปรุงการควบคุม MP ในพื้นที่อย่างมีนัยสำคัญ และแรงแม่เหล็กที่รุนแรงที่เกิดขึ้นนั้นยากต่อการปรับ ทำให้วิธีนี้ใช้งานได้จริงน้อยลงในทำนองเดียวกัน การวางแม่เหล็กเหนือและข้ามหลอดลม (รูปที่ 3 มิติ) ก็ไม่ได้เพิ่มจำนวนของอนุภาคที่เหลืออยู่ในพื้นที่ที่ถ่ายภาพการกำหนดค่าทางเลือกบางอย่างเหล่านี้อาจไม่ประสบความสำเร็จเนื่องจากส่งผลให้ความแรงของสนามแม่เหล็กในเขตการสะสมลดลงดังนั้นการกำหนดค่าแม่เหล็กเดี่ยวที่ 30 องศา (รูปที่ 3a) จึงถือเป็นวิธีการทดสอบในร่างกายที่ง่ายและมีประสิทธิภาพมากที่สุด
การศึกษา LV-MP แสดงให้เห็นว่าเมื่อ LV vectors ถูกรวมเข้ากับ CombiMag และส่งมอบหลังจากถูกรบกวนทางร่างกายต่อหน้าสนามแม่เหล็ก ระดับการถ่ายโอนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหลอดลมเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมจากการศึกษาเกี่ยวกับการถ่ายภาพซินโครตรอนและผลลัพธ์ของ LacZ สนามแม่เหล็กดูเหมือนจะสามารถเก็บ LV ไว้ในหลอดลมและลดจำนวนของอนุภาคพาหะที่เจาะเข้าไปในปอดได้ทันทีการปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายดังกล่าวสามารถนำไปสู่ประสิทธิภาพที่สูงขึ้นในขณะที่ลด titers ที่ส่งมอบ การถ่ายทอดที่ไม่ได้กำหนดเป้าหมาย ผลข้างเคียงจากการอักเสบและภูมิคุ้มกัน และต้นทุนการถ่ายโอนยีนที่สำคัญ ตามที่ผู้ผลิตระบุ CombiMag สามารถใช้ร่วมกับวิธีการถ่ายโอนยีนอื่นๆ รวมถึงเวกเตอร์ไวรัสอื่นๆ (เช่น AAV) และกรดนิวคลีอิก